猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的制备及对病毒蛋白EDIII表位的鉴定

论文摘要

猪流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）,简称乙脑,是由猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）引起的常见病毒性脑炎,对人的致死率高,约为25---40%,对猪的致死率不高,但引起造成怀孕母猪发生繁殖障碍是主要的经济损失,对作为畜牧业支柱产业的养猪业持续增产造成巨大的危害。近年来,乙脑的传染范围不断扩大,严重威胁公共安全和养殖业。而抗乙脑病毒的中和性单抗能够有效地降低病毒的致病能力,且具有较高的特异性和生物学活性,在病毒的诊断检测和治疗预防中有着良好的应用前景。本文用常规的杂交瘤制备技术获得了抗乙脑病毒（NJ2008株,GQ918133,以下实验中所用的乙脑病毒均为此株）的7株单抗,用BHK-21细胞培养后冻于-20℃,反复冻融三次后经蔗糖密度梯度离心,将所获纯化病毒免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA法进行筛选,抗原即为免疫原,加强免疫时用EDHI,筛选时分别用EDIII和纯化的乙脑病毒筛选。最后获得七株能稳定分泌的杂交瘤细胞,分别命名为1H5F9、2D7E4、2B4B4、1H4、2E3、2B4、4D4,然后用常规方法免疫小鼠制备腹水,并测亚型后用Protein A纯化柱纯化。用ELISA、Western Blot、IFA、流式细胞术以及中和实验等方法鉴定7株单抗的生物学特性。结果显示1H5F9、2D7E4、2B4B4能识别BHK-21细胞的蛋白,1H4和2B4只识别EDⅢ而2E3和4D4两种都能识别,因此1H5F9、2D7E4、2B4B4由于只识别细胞而淘汰,2E3和4D4则在后续的实验作为对照。中和试验结果显示4株单抗都有一定的中和活性,且结果为：2B4>1H4～4D4>2E3。临床实例应用进一步证明用特异性和反应性最高的2B4能够检测出感染JEV的小鼠的脑脊液中JEV的存在及水平。根据单抗特性鉴定的结果,1H4和2B4能与JEV的EDⅢ和MEP都反应,且Western Blot显示表位是在同一个蛋白上,因此推断这2株单抗的识别位点是在EDⅢ和MEP共有序列上的。同时,本文用M13噬菌体展示肽库筛选单抗的表位,以进一步验证上述推断。MegAlign和Blast的结果显示,"HH-H"（E394-E397）是最有可能的结合位点。在此基础上,合成EDⅢ和MEP共有序列多肽,P1:TVN PFV A （E356-E362）和P2：EME PPF GDS YIV VGR GDK QIN HHW HKA （E373-E399）以及含噬菌体筛选出的位点的短肽NHH WHK A （E394-E398）,用ELISA进一步验证,发现1H4与3条肽都反应,而2B4则只与P3反应,并且用P3作为抗原能够检测猪的乙脑阳性血清,说明E394HHE398有效诱导产生抗体,且E396-M很可能是决定中和活性的一个关键位点。空间构象和理化分析显示该位点在p折叠的末端,且B94HHWHE398富含亲水氨基酸,能够作为表位诱导机体免疫反应。因此,该位点对乙脑的进一步研究有着重要的意义,单抗1H4和2B4也有望应用于建立相应的检测方法和疫苗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 文献综述 日本乙型脑炎的研究进展
• 一、日本乙型脑炎流行病学特征
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状和病理变化
• 二、日本乙型脑炎病毒分子生物学特征及致病机制
• 1 乙型脑炎病毒蛋白的特点
• 2 乙型脑炎病毒的基因分型
• 3 病毒变异
• 4 JEV的生物合成
• 5 日本乙型脑炎的致病机制
• 三、日本乙型脑炎的诊断检测方法研究进展（主要介绍单克隆抗体技术和噬菌体展示肽库技术）
• 1. 日本乙型脑炎诊断技术的应用发展
• 2. 单克隆抗体制备技术的研究发展
• 3. 噬菌体展示肽库筛选技术的研究发展
• 4. JEV的疫苗研究进展
• 5. 抗原表位研究进展
• 四、日本乙型脑炎的综合防治
• 1. 饲养管理
• 2. 传播途径的防控
• 3 免疫防治
• 4 加强监测
• 5 积极宣传
• 参考文献
• 第一章 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的制备
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 实验材料
• 1.1 病毒及细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 制备纯的全病毒抗原
• 2.2 杂交瘤细胞系的建立
• 2.3 体内诱生腹水法制备单抗
• 2.4 单克隆抗体的纯化
• 2.5 杂交瘤细胞培养上清及单抗的效价测定
• 3 试验结果
• 3.1 抗原的制备、纯化及鉴定
• 3.2 小鼠的免疫
• 3.3 杂交瘤细胞株的建立
• 3.4 杂交瘤细胞培养上清及单抗的效价测定
• 3.5 抗体分泌稳定性测试
• 3.6 单克隆抗体的亚型测定和纯化
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的特性鉴定
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 实验材料
• 1.1 病毒及细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 免疫印迹（Western Blot）
• 2.2 间接免疫荧光（IFA）
• 2.3 流式细胞术分析单抗2B4在自然条件下与BHK细胞以及感染JEV的BHK细胞的结合情况
• 2.4 中和实验
• 2.5 ELISA鉴定单抗与某些JEV蛋白的反应
• 2.6 单抗2B4检测患乙型脑炎乳鼠脑脊液的应用
• 3 实验结果
• 3.1 免疫印迹（Western Blot）和间接免疫荧光（IFA）
• 3.2 流式细胞术分析单抗在自然条件下与BHK细胞以及感染JEV的BHK细胞的结合情况
• 3.3 中和实验
• 3.4 ELISA鉴定单抗与某些JEV蛋白的反应
• 3.5 单抗2B4检测患乙型脑炎乳鼠脑脊液的应用
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪流行性乙型脑炎EDⅢ表位的鉴定
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 实验材料
• 1.1 病毒、细菌及细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 用噬菌体表面展示肽库初步筛选单抗的表位
• 2.2 用MegAlign和Blast分析同源性序列
• 2.3 合成多肽并用ELISA确认作用位点
• 3 实验结果
• 3.1 噬菌体表面展示肽库初步筛选单抗的表位
• 3.2 阳性噬菌体克隆的噬菌体ELISA检测、测序和同源性分析
• 3.3 合成多肽并用ELISA确认作用位点
• E394HHWH^E397的空间构象及理化分析'>3.4^E394HHWH^E397的空间构象及理化分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 1 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的制备
• 2 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的特性鉴定
• 3 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的EDⅢ表位的鉴定
• 附录
• 1. SDS-PAGE中主要试剂的配制
• 2. ELISA中主要试剂的配制
• 3. WESTERN BLOT分析中主要溶液的配制
• 4. 单抗纯化试剂
• 5. 细胞培养中所用溶液的配制
• 6. 噬菌体展示肽库筛选中所用到的试剂
• 7. 其它常用试剂的配制
• 致谢