乐果降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究

论文摘要

乐果（dimethoate）是世界上使用很广的一种有机磷杀虫剂和杀螨剂,用于蔬菜、果树、茶、桑、棉、油料作物、粮食作物上多种虫害的防治。但是它的大量使用对环境和人类造成了很大危害。同时,乐果为水溶性农药,可能因稻田渗漏和暴雨径流、稻田排水进入地表水和地下水而污染引用水资源。通过近40年的研究,人们充分肯定了微生物在土壤和水体中农药降解的重要作用,环境污染的微生物修复具有其它修复方法无可比拟的优势,因此如何开发利用参与环境净化的微生物资源,进一步充分有效地发挥其潜在的修复环境污染的能力,已成为人类生产活动中的重要课题。本研究的意义在于分离、筛选能够以乐果作为唯一碳源生长的降解菌株,并对该菌株在各种环境条件下降解乐果的特性进行研究,以期为乐果环境污染的修复工作提供科学依据。从农药厂废水处理池的污泥中分离到一株能以乐果为唯一碳源生长的细菌,命名为L3。根据其生理生化特征和16S rRNA（GenBank Accession No.EU004590）基因序列分析,将该菌株初步鉴定为副球菌属（Paracoccus sp.）。L3生长的最适pH为7.0,最适温度为35℃。在NaCl浓度在0%-6%时,菌体生长良好;L3具有链霉素抗性;通过煮沸法和碱裂解法均未发现菌体有质粒存在,降解基因可能存在于染色体上。菌株L3能够以乐果作为唯一碳源生长,乐果浓度为300mg/L时菌体生长最好;能在6h内降解100mg/L的乐果至无法检出,降解效果明显优于国内外已经报道的乐果降解菌株;L3降解乐果的最适接种量为3%,温度为35℃,装液量为30/250mL,中性稍微偏碱的环境更有利于其对乐果的降解。L3能够降解其他有机磷化合物辛硫磷、毒死蜱和对硫磷,而对敌敌畏、甲胺磷、氧化乐果等没有降解效果,由此推测,L3可能对P=S键有底物专一性。高效降解菌株L3在菜园土中的降解实验表明,土壤的灭菌与否对乐果的降解影响不大,土壤中乐果的降解主要是由降解菌来完成的,土著微生物影响甚微;降解效率随接种量增加而增高,但达到一定浓度时降解效率基本稳定;乐果在土壤中的降解需要一定的水分含量,稍高的水分含量更有利于其对乐果的降解,但含水量过高又会影响到其对乐果降解功能的发挥;与最适生长特点相符的是,在土壤中L3适宜的降解pH值和温度分别为8.0和35℃。乐果降解酶是一种胞内组成型酶。降解酶的最佳反应体系为在pH7.0的缓冲系统中,控制温度为30℃,在5mL反应体系中添加30μL的粗酶液,反应时间为30分钟;乐果降解酶在pH7.0～8.0,温度4～30℃的范围内较稳定;金属离子Zn2+对降解酶的活性有抑制作用;粗酶液的硫酸铵分级沉淀效果表明,沉淀蛋白在硫酸铵的添加浓度达到20%以后,酶活骤然上升,在60%以后达到最大。所以在用硫酸铵沉淀粗酶时可选择60%的硫酸铵沉淀浓度对降解酶进行粗分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 有机磷农药残留污染现状及其生物修复
• 1 有机磷农药污染现状
• 1.1 有机磷农药对环境的危害
• 1.2 有机磷对食品的危害
• 1.3 有机磷农药对生物的影响
• 2 有机磷农药在土壤中的环境行为
• 2.1 扩散作用
• 2.2 土壤的吸附作用
• 2.3 挥发作用
• 3 有机磷农药在土壤中的降解
• 3.1 化学降解
• 3.2 环境光降解
• 3.3 植物降解
• 3.4 微生物降解
• 4 有机磷农药残留的微生物修复现状
• 4.1 降解菌的分离
• 4.2 微生物降解有机磷农药的机理
• 4.3 降解基因的克隆与工程菌的构建
• 4.4 影响微生物降解有机磷农药的因子
• 5 乐果概述
• 5.1 理化性质
• 5.2 毒性
• 5.3 应用范围
• 5.4 乐果残留危害
• 5.5 乐果降解途径
• 5.6 乐果微生物降解相关研究
• 参考文献
• 第一章 乐果降解菌株的分离、筛选及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与培养基
• 1.2 高效降解菌株的富集和分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株16S rDNA序列的扩增与分析
• 1.5 降解菌株的系统发育分析
• 1.6 质粒DNA的小量提取
• 1.7 乐果的提取
• 1.8 乐果含量的测定方法
• 1.9 细菌的生长量检测
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株的富集和分离
• 2.2 降解菌株的形态和培养特征
• 2.3 降解菌株的生理生化特征
• 2.4 L3系统发育分析
• 2.5 环境条件对L3生长的影响
• 2.5.1 温度对降解菌株生长的影响
• 2.5.2 pH值对降解菌株生长的影响
• 2.5.3 通气量对菌体生长的影响
• 2.5.4 NaCl浓度对降解菌株生长的影响
• 2.5.5 降解菌株的碳源利用情况
• 2.5.6 降解菌株的氮源利用情况
• 2.5.7 降解菌株的抗生素耐受情况
• 2.6 L3质粒提取
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 高效降解菌株降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株、培养基及试剂
• 1.2 菌株的培养及种子液的制备
• 1.3 培养条件对菌株生长和乐果降解的影响
• 1.3.1 乐果浓度对L3生长的影响
• 1.3.2 环境因素对L3生长和乐果降解的影响
• 1.4 降解谱试验
• 1.5 分析方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 乐果浓度对L3生长的影响
• 2.2 菌株以乐果为唯一碳源的生长及降解试验
• 2.3 温度对L3降解乐果的影响
• 2.4 pH值对L3降解乐果的影响
• 2.5 接种量对L3降解乐果的影响
• 2.6 农药起始浓度对L3降解乐果的影响
• 2.7 通气量对降解的影响
• 2.8 L3的降解谱
• 3 本章小结
• 参考文献:
• 第三章 乐果污染土壤的生物修复研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、培养基与试剂
• 1.2 菌株的培养及菌悬液的制备
• 1.3 供试土壤
• 1.4 壤中乐果及高效降解菌的施用
• 1.5 土壤中乐果的提取与测定
• 1.6 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 灭菌和未灭菌土壤中乐果的降解
• 2.2 土壤pH值对降解的影响
• 2.3 土壤温度对降解的影响
• 2.4 接种量多少对降解的影响
• 2.5 土壤水分含量对降解的影响
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 乐果降解菌L3酶学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株、培养基及试剂
• 1.2 菌株培养
• 1.3 粗酶液的制备
• 1.4 降解酶的定位
• 1.5 降解酶的类型
• 1.6 降解酶的硫酸铵沉淀粗分
• 1.7 pH、温度对乐果降解酶活性的影响
• 1.8 金属离子对酶活性的影响
• 1.9 酶活测定反应体系
• 1.10 蛋白质含量的测定
• 1.11 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 乐果降解酶的定域实验
• 2.2 降解酶的类型
• 2.3 硫酸铵沉淀
• 2.4 酶的反应进程曲线
• 2.5 酶浓度选择
• 2.6 pH、温度对乐果降解酶活性的影响
• 2.7 金属离子对酶活性的影响
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 论文的创新点
• 附录1 文中所用培养基及试剂配方
• 附录2 菌株的16S rDNA序列
• 附录3 攻读硕士学位期间发表的文章
• 致谢