论文摘要
人体内血管紧张素转换酶(ACE)活性过高是引起高血压的关键因素。ACE抑制肽能竞争性地与ACE活性中心结合,而抑制ACE的活性,起到降血压的作用。现有研究表明,这些多肽分子量大都在200-2000之间,且以2-10个氨基酸残基组成的肽较为多见。近年来,国内外利用食物蛋白获取ACE抑制肽的研究广泛开展,日本已有产品上市。目前,我国在这方面的研究逐渐兴起,但还未进行工业化生产。本研究以酪蛋白为原料,通过筛选出最佳蛋白酶,并对酶解条件进行优化,制备出了具有较高抑制活性的ACE抑制肽;同时,通过超滤和凝胶层析对酶解产生的ACE抑制肽进行分离纯化,并研究了具有最高ACE抑制活性的凝胶层析组分的多肽分子量分布和结构初步推测。主要研究结果如下:1、根据Cushman等的方法,对血管紧张素转换酶抑制肽活性体外检测方法进行了优化,调整了反应体系中ACE用量,抵消了HHL、酶解物等对检测结果的影响,验证了方法的可靠性、重复性和精确性,确立了简便可行的ACE抑制肽体外活性检测方法。2、采用胃蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase五种蛋白酶,分别在各自最适条件下水解酪蛋白,通过比较水解过程和酶解产物的ACE抑制活性,筛选出最佳蛋白酶Alcalase用于ACEIP制备。酪蛋白经该酶水解5小时后,产物的ACE抑制活性达到最大,ACE抑制率为56.1±0.7%。3、选取Alcalase水解酪蛋白制备血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIP)。试验中选择温度、酶与底物浓度比、底物浓度、pH值等影响酶解因素的不同水平,以酶解产物的ACE抑制率为指标,采用响应曲面法对酶解条件进行了优化,并建立了酶解产物ACE抑制率的多元二次回归模型方程。实验表明,在温度为60℃、酪蛋白浓度为7.11%、Alcalase和酪蛋白浓度比为7.83%、pH为7.0时,水解4小时所得酶解液ACE抑制率为70.5%,比蛋白酶筛选时所得抑制率提高了25.7%。酶解产物的IC50为0.54mg/mL。4、在最佳条件下水解酪蛋白制备ACEIP。选用分子截留量为3kDa的膜对酶解液进行超滤,然后经SephadexG-15凝胶层析分离,并对其中一组分通过RP-HPLC和ESI-MS进行了分析。实验结果表明,超滤使ACE抑制活性提高了8.8%,IC50下降了0.15mg/mL。超滤物经凝胶层析后得到7个具有ACE抑制活性的组分,其中组分4的IC50为0.057mg/mL。采用RP-HPLC分析发现,组分4成分已较为简单,但还不是纯的多肽。经ESI-MS质谱分析,测定其中主要是分子量在182-752Da之间的多肽。
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