酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽制备及分离纯化研究

酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽制备及分离纯化研究

论文摘要

人体内血管紧张素转换酶(ACE)活性过高是引起高血压的关键因素。ACE抑制肽能竞争性地与ACE活性中心结合,而抑制ACE的活性,起到降血压的作用。现有研究表明,这些多肽分子量大都在200-2000之间,且以2-10个氨基酸残基组成的肽较为多见。近年来,国内外利用食物蛋白获取ACE抑制肽的研究广泛开展,日本已有产品上市。目前,我国在这方面的研究逐渐兴起,但还未进行工业化生产。本研究以酪蛋白为原料,通过筛选出最佳蛋白酶,并对酶解条件进行优化,制备出了具有较高抑制活性的ACE抑制肽;同时,通过超滤和凝胶层析对酶解产生的ACE抑制肽进行分离纯化,并研究了具有最高ACE抑制活性的凝胶层析组分的多肽分子量分布和结构初步推测。主要研究结果如下:1、根据Cushman等的方法,对血管紧张素转换酶抑制肽活性体外检测方法进行了优化,调整了反应体系中ACE用量,抵消了HHL、酶解物等对检测结果的影响,验证了方法的可靠性、重复性和精确性,确立了简便可行的ACE抑制肽体外活性检测方法。2、采用胃蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase五种蛋白酶,分别在各自最适条件下水解酪蛋白,通过比较水解过程和酶解产物的ACE抑制活性,筛选出最佳蛋白酶Alcalase用于ACEIP制备。酪蛋白经该酶水解5小时后,产物的ACE抑制活性达到最大,ACE抑制率为56.1±0.7%。3、选取Alcalase水解酪蛋白制备血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIP)。试验中选择温度、酶与底物浓度比、底物浓度、pH值等影响酶解因素的不同水平,以酶解产物的ACE抑制率为指标,采用响应曲面法对酶解条件进行了优化,并建立了酶解产物ACE抑制率的多元二次回归模型方程。实验表明,在温度为60℃、酪蛋白浓度为7.11%、Alcalase和酪蛋白浓度比为7.83%、pH为7.0时,水解4小时所得酶解液ACE抑制率为70.5%,比蛋白酶筛选时所得抑制率提高了25.7%。酶解产物的IC50为0.54mg/mL。4、在最佳条件下水解酪蛋白制备ACEIP。选用分子截留量为3kDa的膜对酶解液进行超滤,然后经SephadexG-15凝胶层析分离,并对其中一组分通过RP-HPLC和ESI-MS进行了分析。实验结果表明,超滤使ACE抑制活性提高了8.8%,IC50下降了0.15mg/mL。超滤物经凝胶层析后得到7个具有ACE抑制活性的组分,其中组分4的IC50为0.057mg/mL。采用RP-HPLC分析发现,组分4成分已较为简单,但还不是纯的多肽。经ESI-MS质谱分析,测定其中主要是分子量在182-752Da之间的多肽。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩写符号
  • 表格索引
  • 图形索引
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 ACE及其调节血压机理
  • 1.2 ACE抑制肽的作用机理
  • 1.3 ACEIP活性的评价方法
  • 1.4 ACEIP的主要食物蛋白源
  • 1.4.1 乳类蛋白
  • 1.4.2 肉类蛋白
  • 1.4.3 植物蛋白
  • 1.4.4 其他食物或食品来源蛋白
  • 1.5 ACEIP的制备方法及分离纯化
  • 1.5.1 ACEIP的制备
  • 1.5.2 分离纯化方法
  • 1.6 ACEIP结构与功能的关系研究
  • 1.7 研究前景
  • 1.8 本研究的目的及内容
  • 参考文献
  • 第二章 ACEIP抑制活性体外检测方法优化的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 主要设备
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 ACEI抑制活性的测定
  • 1.3.2 ACEIP的制备
  • 1.3.3 数据分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 方法的可靠性研究
  • 2.1.1 反应体系中ACE用量选择
  • 228值的影响'>2.1.2 反应体系物质对A228值的影响
  • 2.1.3 反应体系中抑制肽浓度的确定
  • 2.1.4 反应体系的确定
  • 2.2 方法精确性的研究
  • 2.3 方法重复性的研究
  • 3 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 酶解酪蛋白制备ACEIP蛋白酶的筛选
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 主要设备
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 蛋白酶活力测定
  • 1.3.2 水解度DH(%)的测定
  • 1.3.3 酪蛋白源ACEIP的制备
  • 1.3.4 ACEIP活性检测方法
  • 1.3.5 数据分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 蛋白酶活力的测定
  • 2.1.1 标准曲线的制作
  • 2.1.2 蛋白酶活力的测定
  • 2.2 酪蛋白水解度及水解产物ACE抑制活性的测定
  • 2.3 水解酪蛋白最佳用酶的确定
  • 3 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 Alcalase水解酪蛋白制备ACEIP条件的优化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 主要设备
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 ACE抑制肽活性的体外检测方法
  • 1.3.2 试验设计
  • 1.3.3 水解酪蛋白制备ACEIP
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 多元模型方程的建立与显著性检验
  • 2.2 酪蛋白酶解液ACE抑制率响应曲面分析与优化
  • 2.3 模型验证实验
  • 2.4 水解时间的确定
  • 50测定'>2.5 酪蛋白酶解产物的IC50测定
  • 3 本章小结
  • 参考文献
  • 第五章 酪蛋白源ACEIP的分离纯化和初步分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 主要仪器
  • 1.3 实验方法
  • 1.3.1 酪蛋白Alcalase酶解液的超滤膜分离
  • 1.3.2 超滤液中肽类物质的初步分析
  • 1.3.3 SephadexG-15分离纯化ACEIP
  • 1.3.4 RP-HPLC鉴定凝胶层析各组分纯度
  • 1.3.5 ESI-MS分析
  • 1.3.6 多肽含量的测定
  • 50测定'>1.3.7 ACEIP抑制率和IC50测定
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 超滤分离酪蛋白Alcalase酶解液
  • 2.2 超滤液中肽类物质分析
  • 2.3 SephadexG-15分离纯化ACEIP
  • 2.3.1 不同洗脱剂对分离效果的影响
  • 2.3.2 不同加样量对分离效果的影响
  • 2.3.3 SephadexG-15分离超滤液所得不同组分ACE抑制活性
  • 2.3.4 洗脱液4号峰组分ACE抑制活性
  • 2.4 RP-HPLC对组分4的分析
  • 2.5 ESI-MS分析组分4
  • 3 本章小结
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 全文创新点
  • 致谢
  • 相关论文文献

    • [1].蛋白酶A对纯生啤酒泡持性的影响研究[J]. 中国酿造 2016(12)
    • [2].异乡与蛋白酶[J]. 文苑 2011(03)
    • [3].异乡与蛋白酶[J]. 视野 2011(13)
    • [4].蛋白酶生产及应用的相关研究进展[J]. 食品界 2016(08)
    • [5].蛋白酶K的研究进展[J]. 食品工业科技 2013(14)
    • [6].酿酒酵母蛋白酶A外泌与酒类酿造[J]. 天津科技大学学报 2013(05)
    • [7].三种蛋白酶对制革浸水应用效果的影响[J]. 中国皮革 2010(09)
    • [8].蛋白酶 A 与纯生啤酒泡沫稳定性的关系研究[J]. 啤酒科技 2008(12)
    • [9].蛋白酶及其除了节约成本外的其他好处[J]. 国外畜牧学(猪与禽) 2014(05)
    • [10].不同底物对蛋白酶K酶活力测定的影响[J]. 河北农业大学学报 2017(01)
    • [11].1株蜡状芽孢杆菌产脱毛蛋白酶的酶性质研究[J]. 贵州农业科学 2010(09)
    • [12].鱼露产蛋白酶菌产酶条件优化[J]. 食品科技 2015(02)
    • [13].采用荧光底物法检测纯生啤酒蛋白酶A方法的研究[J]. 酿酒科技 2009(04)
    • [14].北黄海沉积物可培养产蛋白酶细菌分离鉴定[J]. 微生物学报 2017(10)
    • [15].工业化酿造过程中酵母分泌蛋白酶A的规律及影响因素的研究[J]. 食品工业科技 2015(12)
    • [16].饲用蛋白酶的研究进展[J]. 饲料工业 2009(22)
    • [17].蛋白酶A与啤酒蛋白的相互作用[J]. 啤酒科技 2008(04)
    • [18].蛋白酶:为后抗生素时代做好准备[J]. 国外畜牧学(猪与禽) 2017(12)
    • [19].耐高温蛋白酶产生菌的筛选及酶学特性的初步研究[J]. 食品工业科技 2017(03)
    • [20].蛋白酶K的性质及其在核酸提取中的应用[J]. 食品研究与开发 2017(10)
    • [21].饲用蛋白酶在动物营养与饲料生产中的应用[J]. 饲料与畜牧 2016(01)
    • [22].蛋白酶K水解蜂王浆蛋白的研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学) 2016(02)
    • [23].蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌系统中的高效表达[J]. 生物加工过程 2015(03)
    • [24].蛋白酶在动物生产中的应用[J]. 饲料与畜牧 2011(08)
    • [25].嗜热芽孢杆菌产耐热蛋白酶稳定性的研究[J]. 中国计量学院学报 2009(02)
    • [26].在非反刍动物饲料中运用单一组分外源性蛋白酶创造最优价值(续2)[J]. 国外畜牧学(猪与禽) 2018(07)
    • [27].蛋白酶在食品加工中的应用进展研究[J]. 食品工程 2014(01)
    • [28].蛋白酶A检测方法的改进[J]. 啤酒科技 2014(03)
    • [29].蛋白酶A敲除对酿酒酵母抗氧化性的影响[J]. 中国食品学报 2013(02)
    • [30].酿酒酵母蛋白酶A的生化特性及生物学功能[J]. 啤酒科技 2013(03)

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  

    酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽制备及分离纯化研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢