骨桥蛋白的原核表达、纯化及生物学活性研究

论文摘要

目的:骨桥蛋白（ Osteopontin , OPN ）是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白,可由多种组织细胞合成与分泌。近年来的研究表明,OPN作为机体反应性蛋白,在机体炎症、组织损伤与修复等病理过程中具有重要的功能和作用。在心血管系统中,OPN通过与血管内皮和平滑肌细胞（VSMC）表面的整合素受体相互作用而介导细胞黏附和迁移,进而参与血管内皮损伤所导致的内膜增生的发生与发展过程。为了研究OPN诱导VSMC黏附和迁移的分子机制及其在血管内膜增生中的作用,制备OPN是必要的。为此,本实验利用基因重组技术,将OPN cDNA与携带GST编码序列的原核表达载体进行重组后,在大肠杆菌中表达得到GST-OPN融合蛋白,为进一步研究该蛋白在血管内膜增生中的作用奠定了基础。方法:1 OPN原核表达质粒的构建将OPN cDNA片段克隆入pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-1-OPN质粒,经限制性内切酶图谱和DNA序列分析对重组质粒进行鉴定。2 GST-OPN融合蛋白在大肠杆菌中的表达2.1 GST-OPN融合蛋白的诱导表达将pGEX-4T-1-OPN转化大肠杆菌后,对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化,确定GST-OPN融合蛋白诱导表达的最佳条件。在最佳条件下对pGEX-4T-1-OPN转化菌进行诱导培养后,将菌体裂解后离心,分别收集上清和沉淀,经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞中的存在形式。2.2 GST-OPN融合蛋白的分离纯化菌体经裂解及离心后取上清,用GST-Sepharose 4B亲和层析对GST-OPN融合蛋白进行纯化。3 GST-OPN融合蛋白生物学活性检测3.1细胞黏附实验将传代的VSMC接种到用OPN包被的96孔板中,检测单位时间内黏附至孔板上的细胞数,以此表示细胞黏附活性。以从VSMC培养基中提取的天然OPN和GST蛋白作为平行对照,以确定GST-OPN促进细胞黏附的特异性。3.2伤口愈合实验细胞传代时,将VSMC接种于带有玻片的孔板内,细胞生长至100 %汇合后,用无菌吸头在玻片上划痕。PBS洗净刮下的细胞,将玻片放回孔板内,每孔加入23 mg/L GST-OPN,继续孵育24 h后,于低倍镜下观察细胞伤口愈合程度,以此表示细胞的迁移活性。以从VSMC培养基中提取的天然OPN和GST蛋白作为平行对照,以确定GST-OPN促进细胞迁移的特异性。结果:1重组质粒pGEX-4T-1-OPN的构建以含有OPN cDNA序列的重组质粒OP10 （ Dr.Larry Fisher惠赠）为模板进行PCR扩增得到的OPN cDNA片段与pGEX-4T-1载体连接得到重组表达质粒。重组质粒经Bam H I / XhoⅠ双酶切后进行电泳鉴定时出现长度为860 bp左右的插入片段,与预期结果相一致。测序分析结果与GenBank收录的OPN cDNA序列进行比对,证明插入片段的序列是正确的。2 GST-OPN融合蛋白的诱导表达转化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌经IPTG诱导后可表达分子量约75 kD的蛋白质。在培养物OD600 = 1.5时按1:50的比例接种于含0.1 mmol/L IPTG的LB培养液中,25℃诱导培养6 h的条件下, GST- OPN融合蛋白的表达量在菌体蛋白中所占比例最大,融合蛋白主要以可溶性形式存在。此条件作为GST-OPN融合蛋白诱导表达的最佳条件。3 GST-OPN融合蛋白的分离纯化转化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌在最佳条件下被诱导培养后,离心收集菌体,用PBS（ pH 7.3 ）重悬后加NaOH调pH值为8.0,以达到溶菌酶发挥作用的最适pH,用溶菌酶室温消化后加Triton X-100以防止蛋白交联。离心收集上清,加谷胱甘肽琼脂糖珠共孵育,经PBS洗涤45次后,用还原型谷胱甘肽洗脱液进行数次洗脱,合并收集的洗脱液。取适量洗脱液进行SDS-PAGE,结果可见清晰的单一的75 kD蛋白条带,说明经亲和层析纯化的GST-OPN已达电泳纯。100 ml培养物经亲和层析纯化后,得到约3 mg可溶性GST-OPN融合蛋白。4 GST-OPN融合蛋白对VSMC黏附的影响本研究观察重组GST-OPN融合蛋白对细胞黏附的影响。实验发现,GST-OPN融合蛋白能够显著促进VSMC的黏附,其作用与天然OPN相比无统计学差异。平行对照中的GST蛋白不影响VSMC的黏附。5 GST-OPN融合蛋白对VSMC迁移的影响VSMC迁移是由细胞与细胞外基质及多种细胞因子相互作用所介导的。细胞外基质中的OPN作为整合素的主要配体在VSMC迁移中发挥重要作用。本实验研究重组OPN对细胞迁移的影响,与黏附实验分组相同。结果发现,GST-OPN可明显促进细胞的迁移,其作用与天然OPN相比无统计学差异,平行对照实验中的GST蛋白对VSMC的迁移没有影响。结论:1成功构建了含有OPN基因序列的pGEX-4T-1-OPN原核表达质粒。2经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化,25℃条件下用0.1 mmol/L IPTG诱导6 h,GST-OPN融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。3菌体经裂解及离心后取上清,经GST-Sepharose 4B亲和层析得到电泳纯的GST-OPN融合蛋白。4 GST-OPN融合蛋白能显著促进VSMC黏附。5 GST-OPN融合蛋白能显著促进VSMC迁移。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 骨桥蛋白的原核表达、纯化及生物学活性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 骨桥蛋白与血管钙化
• 致谢
• 个人简历