论文摘要
肿瘤的侵袭和转移是一个多环节、多阶段的过程,除与肿瘤细胞本身粘附、运动、增殖、降解细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）及肿瘤血管生成等有关外,机体的免疫系统在该过程中也具有重要作用。肿瘤细胞通过逃避机体的免疫监视和攻击,进而在体内不受限制的生长和发生远处转移。Fas/FasL系统是体内介导细胞凋亡的一对糖蛋白分子,在免疫自稳、免疫特赦,维持眼、睾丸、胎盘等生理性免疫赦免组织的正常功能,以及恶性肿瘤的发生发展中意义显著。在肿瘤细胞中,Fas表达下降, Fas配体（Fas ligand,FasL）表达增加,直接参与或间接促进了肿瘤逃避机体免疫系统的监视,从而有利于肿瘤细胞的进展和转移。细胞跨膜糖蛋白层黏素受体（laminin receptor, LNR）过表达是恶性实体肿瘤侵袭和转移过程中的共同现象,鉴于Fas/FasL介导的免疫逃逸在侵袭和转移中可能发挥重要作用,我们推测,LNR过表达可能是通过对Fas/FasL系统的调节,参与了肿瘤细胞的免疫逃逸过程,进而发挥了对侵袭和转移的促进作用。肿瘤细胞表面的细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）是参与介导细胞间粘附、识别的重要因子。它是淋巴细胞相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1,LFA-1）的主要配体,是细胞粘附迁移及提呈抗原的重要介导分子。肿瘤细胞膜表面ICAM-1表达减少或丢失,将使肿瘤细胞逃避细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞等免疫活性细胞的识别和杀伤作用。鉴于LNR过表达介导肿瘤侵袭和转移的多个重要环节,LNR和ICAM-1在肿瘤细胞之间的关系密切,LNR有可能会通过ICAM-1在介导免疫逃逸的过程中发挥作用。因此我们推想,LNR过表达可能通过改变ICAM-1等细胞表面重要分子的表达,干扰免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和结合,通过Fas/FasL信号通路的介导,阻碍免疫活性细胞对肿瘤细胞的攻击,促进肿瘤细胞的免疫逃逸。通过下调肿瘤细胞层黏素受体的表达,干扰肿瘤细胞中免疫逃逸的信号通路,将有可能降低肿瘤细胞的免疫逃逸能力,从而可能达到限制其侵袭和转移的目的。课题研究内容及实验设计如下:一、LNR过表达对胆管癌细胞生物学行为的影响。用流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）检测胆管癌细胞层黏素受体的表达并分选高表达层黏素受体的胆管癌细胞亚群;用HE染色、扫描电镜及透射电镜观察分选前、后两组细胞形态学的变化;用细胞骨架染色法观察两组细胞的骨架蛋白变化;用随机运动实验和侵袭实验观察两组细胞的侵袭和转移能力变化。二、LNR过表达对胆管癌细胞免疫逃逸相关因子的影响。设计层黏素受体RNA干扰（RNA interfere,RNAi）序列,构建RNAi质粒,经测序、鉴定符合实验设计要求后转染至高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群中,沉默层黏素受体在基因和蛋白水平表达。用定量PCR、western blot以及明胶酶谱法检测胆管癌细胞转染前、后的某些基因（FasL、MMP-2、MMP-9、ICAM-1等）功能改变。三、LNR过表达对胆管癌细胞ICAM-1表达的影响及其机制。用基质金属蛋白酶特异性抑制剂（GM6001）抑制基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）的活性,观察两组细胞的ICAM-1表达变化并分析可能的机制。四、胆管癌LNR过表达对免疫活性细胞的影响。建立胆管癌细胞与人Jurkat细胞Transwell?小室旁分泌共培养模型,用TUNEL法检测胆管癌细胞转染层黏素受体RNA干扰质粒前、后对Jurkat细胞凋亡的影响,并分析层黏素受体可能参与胆管癌免疫逃逸的分子机制。本组实验主要的结果如下:1.用流式细胞技术成功分选出高表达层黏素受体的胆管癌细胞亚群。用HE染色观察分选前、后两组细胞形态学的变化。结果,两组细胞HE染色可见,细胞体均呈圆形、椭圆形、纺锤形,偶见多角形,大小不一,折光性强;细胞膜清晰、完整,核质较大;胞核界限清楚,可见一至多个核仁,核分裂相多见。总体上看,高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群的胞体较低表达层黏素受体胆管癌细胞的胞体伸展,胞膜表面突起增多,异型性更明显。2.细胞骨架蛋白染色观察,两组胆管癌细胞质内清晰可见骨架蛋白（微丝、微管和中间纤维）呈蓝色丝网状结构,近核侧较致密,相邻细胞间有骨架束彼此穿行。整体上看两组细胞骨架结构分布类似,排列较规则,而高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群细胞骨架结构明显紊乱,斑点状肌动蛋白小体、胞体突起及胞膜表面长丝状结构增多。3.扫描电镜和透射电镜下,胆管癌细胞均呈大小不等的椭圆形或短梭形,但高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群的胞体表面突起较低表达层黏素受体胆管癌细胞明显增多,片状伪足宽厚,丝状伪足细长而密集。4.随机运动实验和侵袭实验表明高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群的运动和侵袭能力较低表达层黏素受体胆管癌细胞明显增强。5.成功构建层黏素受体RNAi质粒,经测序、鉴定符合实验设计要求。6.高表达层黏素受体胆管癌细胞亚群转染层黏素受体RNAi质粒后,伴随胆管癌细胞层黏素受体表达的下调,胆管癌细胞的黏附能力下降,胆管癌细胞的MMP-2、MMP-9、uPA mRNA及蛋白表达降低,而胆管癌细胞表面ICAM-1的mRNA及蛋白表达却增加。用基质金属蛋白酶特异性抑制剂（GM6001）抑制MMP-2和MMP-9的活性后,胆管癌细胞表面ICAM-1的蛋白表达较对照组明显增加。说明胆管癌细胞层黏素受体高表达可增加MMP-2、MMP-9活性,可能降解肿瘤细胞表面ICAM-1,进而逃避机体免疫细胞的杀伤,促进胆管癌细胞免疫逃逸。7.转染层黏素受体RNAi质粒至高表达层黏素受体的胆管癌细胞亚群中后发现胆管癌的层黏素受体表达下降,与此同时,胆管癌FasL在基因和蛋白水平的表达也均随之降低。本实验可初步得出在胆管癌细胞中层黏素受体过表达可能与FasL的表达有内在的联系。8.人Jurkat细胞与胆管癌细胞共培养后,Jurkat细胞的凋亡指数明显增加。层黏素受体RNA干扰质粒转染胆管癌细胞能减弱胆管癌细胞诱导Jurkat细胞的凋亡。初步证明胆管癌细胞层黏素受体过表达可能在胆管癌细胞免疫逃逸过程中发挥重要作用。综上所述,本研究主要结论如下:1.胆管癌细胞中层黏素受体高表达可明显增强其侵袭和转移能力。2.胆管癌细胞LNR过表达,通过分泌MMP-2、MMP-9及uPA等蛋白分子,降解胆管癌细胞表面的黏附分子（ICAM-1）等物质,将使胆管癌细胞逃避细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞等免疫活性细胞的识别和杀伤作用,进而可促进胆管癌细胞的侵袭和转移。3.胆管癌细胞LNR过表达,可上调胆管癌细胞FasL的表达。胆管癌细胞层黏素受体高表达可能通过Fas/FasL信号通路增强其逃避机体免疫监视能力,同时胆管癌细胞LNR过表达可能通过Fas/FasL信号通路诱导T淋巴细胞凋亡,进而促进胆管癌细胞转移。
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