肉鸭脂肪性状相关候选基因的克隆、表达及其与胴体和脂肪性状的关联分析

论文摘要

脂肪沉积受多基因控制,但实验发现单基因的突变也可改变脂肪沉积的状况。肉鸭脂肪沉积过多使得饲料利用率和胴体品质下降,并且随着人们生活水平的不断提高,由于脂肪摄入过多而产生的各种疾病已引起大家的广泛关注,这在一定程度上制约了肉鸭业的发展。因此,深入了解肉鸭体内脂肪分布和生长发育的差异,提高肌间脂肪含量、控制脂肪在体内的过多蓄积,进一步提高肉鸭的饲料转化率和改善肌肉品质是当前要解决的重大问题。本研究以北京鸭肝脏组织为试验材料,采用RT-PCR法克隆北京鸭脂肪性状候选基因脂肪分化相关蛋白（ADRP）、过氧化物酶体增殖剂激活受体α（PPARα）、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因,并对其进行生物信息学分析;采用RT-PCR法和实时荧光定量PCR法研究了上述4个基因在8周龄北京鸭不同组织中的表达规律;构建原核表达载体,研究了PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ在大肠杆菌中的表达情况;以SSCP与DNA测序相结合的方法研究了PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ基因不同外显子的遗传多样性及其与胴体和脂肪性状的相关性,取得如下结果:1北京鸭脂肪性状候选基因的克隆及生物信息学分析成功克隆了北京鸭ADRP、PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ基因,其长度分别为1311bp、1430bp、1650bp和620bp,均包括完整的编码区序列,将其提交GenBank获得序列号分别为EU303280、EF534215、EF546801和EU031044。对ADRP、PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ进行人、鸡和鸭间的核苷酸和氨基酸同源性分析,发现同源性均在75 %以上;对北京鸭上述基因编码的蛋白质进行结构和功能预测,结果表明ADRP蛋白没有复杂的空间结构;PPARα和PPARγ蛋白各含有一个ZnF-C4结构域和HOLI结构域,而PPARγ蛋白含有一个信号肽切割位点,位于第29和30个氨基酸之间;IGF-Ⅰ蛋白含有两个强的跨膜螺旋,信号肽区域位于148个氨基酸,其切割位点位于第48和49个氨基酸之间,此外该蛋白还有一个IIGF结构域。2北京鸭脂肪性状候选基因的组织表达规律研究采用RT-PCR法检测8周龄北京鸭胸肌、腹脂、肝脏、肾脏、心脏、小肠、肺脏、肌胃和脾脏等9个组织中ADRP、PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ基因的表达量,结果表明ADRP基因在公鸭和母鸭中均在肾脏中的表达量最高,其次为腹脂、肺脏、心脏、小肠、肝脏、脾脏、胸肌,在肌胃中的表达量最低,且大多数组织中母鸭的表达量大于公鸭。PPARα在公鸭肺脏中的表达量最高,其次为脾脏、腹脂、心脏、肾脏、肌胃、胸肌和肝脏,小肠中的表达量最低;在母鸭中,肾脏中的表达量最高,其次为心脏、肝脏、小肠、肌胃、腹脂、肺脏和脾脏,在胸肌中的表达量最低;其中多数组织中母鸭的表达量高于公鸭。PPARγ在公鸭肺脏中的表达量最高,其次为脾脏、腹脂、心脏、肌胃、胸肌、肝脏和肾脏,在小肠中的表达量最小;在母鸭中,肾脏中的表达量最高,其次为小肠、肌胃、肝脏、腹脂、心脏、脾脏和肺脏,在胸肌中的表达量最低;其中多数组织中公鸭的表达量高于母鸭。IGF-Ⅰ在公鸭心脏中表达量最高,其次为小肠、肌胃、肾脏、肺脏、肝脏、脾脏和胸肌,在腹脂中的表达量最低;在母鸭中,肺脏中表达量最高,其次为脾脏、心脏、肾脏、肌胃、小肠、腹脂和肝脏,在胸肌中的表达量最低;其中公鸭在多数组织中的表达量高于母鸭。采用实时荧光定量PCR法检测结果表明, ADRP基因在腹脂和胸肌中的相对表达量较高,而在其它7个组织中的表达量较少;其中在公鸭和母鸭脂肪组织中的表达量最高,其次为胸肌,在肝脏、脾脏、肌胃、小肠、肾脏、心脏表达量较少,而在肺脏中的表达量很低;且母鸭在多数组织中的表达量高于公鸭。PPARα基因在公鸭和母鸭肝脏中的表达量最高,其次为腹脂、胸肌、肺脏、脾脏、心脏、肌胃和小肠,在肾脏中的表达量最低;其中母鸭在多数组织中表达量高于公鸭。PPARγ基因在公鸭和母鸭腹脂中的表达量最高,其次为肺脏、胸肌、肝脏、肌胃、心脏、脾脏和肾脏,在小肠中的表达量最低;在多数组织中公鸭表达量高于母鸭。IGF-Ⅰ基因在公鸭和母鸭肌胃中的表达量最高,其次为腹脂、肝脏、心脏、小肠、肾脏、胸肌和脾脏,在肺脏中的表达量最低;其中在多数组织中母鸭的表达量高于公鸭。两种方法的检测结果不尽相同,与其它物种中相关组织的表达规律进行比较发现实时荧光定量PCR法的检测结果较RT-PCR法更准确。3 IGF-Ⅰ和PPAR基因的原核表达将IGF-Ⅰ、PPARα和PPARγ基因的编码区插入pET32a （+）载体中成功构建了原核表达载体;结果在大肠杆菌BL21中仅成功表达了带组氨酸标签的34.66kD的IGF-Ⅰ蛋白,且经过Western Blotting检测该蛋白表达正确;优化后的表达条件为28℃、0.3mmol/L IPTG诱导5h;而重组质粒pET32a （+）-PPARα和pET32a （+）-PPARγ在BL21（DE）中没有成功表达。4 PPAR和IGF-Ⅰ基因遗传多样性与鸭脂肪性状的关联分析采用SSCP与DNA测序相结合的方法对PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ基因不同外显子在北京鸭Z2、Z4、杂交系和樱桃谷鸭群体中的遗传多样性及与胴体及脂肪性状之间的相关性进行研究,结果表明PPARα、IGF-Ⅰ及PPARγ基因外显子1、3、4、6在4个鸭群体中均未检测到SNP,而PPARγ基因外显子2和外显子5则各检测到有1个位点的突变,分别为A→C（外显子2）和G→T（外显子5）,且均为同义突变、未引起氨基酸序列的改变。遗传多样性分析结果表明外显子2和外显子5均为中度多态性位点。4.1 PPARγ基因外显子2位点多态性与胴体及脂肪性状的相关分析考虑基因型、性别及基因型与性别之间的互作效应,分别分析PPARγ基因外显子2多态性与北京鸭Z2、Z4、杂交系和樱桃谷鸭群体胴体及脂肪性状的相关性,进行方差分析,结果表明性别及基因型之间的互作效应对4个群体的胴体及脂肪性状的影响均不显著（P>0.05）;性别对北京鸭Z2群体的影响不显著（P>0.05）,性别对北京鸭Z4的胴体重、腿肌重、全净膛重和腹脂率、樱桃谷鸭的胴体重、全净膛重、腹脂率、肌间脂肪含量和杂交系的胴体重、腿肌重、全净膛重、皮脂重、腹脂重和肌间脂肪含量有显著影响（P<0.05）,而对其它性状无显著影响（P>0.05）。对该位点多态性与胴体和脂肪性状进行最小二乘均值分析,结果表明:在北京鸭Z2群体中,该位点多态性与胴体重、胸肌重和腿肌重间无显著相关性（P>0.05）,而与全净膛重、腹脂重、皮脂重、皮脂率、腹脂率和肌间脂肪含量间存在显著相关,且CA型个体均显著优于AA型（P<0.05）;在北京鸭Z4群体中,该位点多态性与胸肌重和全净膛重之间无显著相关性（P>0.05）,而与胴体重、腿肌重、皮脂重、皮脂率、腹脂重、腹脂率、肌间脂肪含量间存在显著相关,且AA型个体均显著优于CA型（P<0.05）;在樱桃谷鸭群体中,该位点多态性与胸肌重和肌间脂肪含量之间无显著相关性（P>0.05）;而与胴体重、腿肌重、全净膛重、皮脂重、腹脂重、皮脂率和腹脂率间存在显著相关,且AA显著优于CC型（P<0.05）;在北京鸭杂交系群体中,该位点多态性与胴体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重和肌间脂肪含量之间无显著相关性（P>0.05）;皮脂重、皮脂率、腹脂重和腹脂率间存在显著相关,且CC型显著优于AA型（P<0.05）。提示该位点对脂肪性状有显著影响。4.2 PPARγ基因外显子5位点多态性与胴体及脂肪性状的相关分析考虑基因型、性别及基因型与性别之间的互作效应,分别分析PPARγ基因外显子5多态性与北京鸭Z2、Z4、杂交系和樱桃谷鸭群体胴体及脂肪性状的相关性,进行方差分析,结果表明性别及基因型之间的互作效应对4个群体的胴体及脂肪性状的影响均不显著（P>0.05）;性别对北京鸭Z2胴体重和全净膛重、北京鸭Z4的胴体重、腿肌重、全净膛重、皮脂率和腹脂率、樱桃谷鸭胴体重、胸肌重、全净膛重、腹脂重、腹脂率和杂交系胴体重、腿肌重、全净膛重、皮脂重、腹脂重和肌间脂肪含量有显著影响（P<0.05）,而对其它性状无显著影响（P>0.05）。对该位点多态性与胴体和脂肪性状进行最小二乘均值分析,结果表明:在北京鸭Z2中,该位点多态性与腿肌重和全净膛重之间无显著相关性（P>0.05）,而与胴体重、胸肌重、皮脂重、腹脂重、皮脂率、腹脂率和肌间脂肪含量间存在显著相关,且GT型显著优于GG型（P<0.05）;在北京鸭Z4中,该位点多态性与胸肌重、腿肌重、全净膛重和肌间脂肪含量之间无显著相关性（P>0.05）,而胴体重、皮脂重、腹脂重、皮脂率和腹脂率间存在显著相关,且TT型显著优于GG型（P<0.05）;在樱桃谷鸭中,该位点多态性与胴体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重和肌间脂肪含量之间无显著差异（P>0.05）,而与皮脂重、皮脂率、腹脂重和腹脂率之间存在显著相关,且TT型显著优于GT型（P<0.05）;在杂交系中,该位点多态性与胴体重、胸肌重、腿肌重和肌间脂肪含量之间无显著差异（P>0.05）,而与全净膛重、皮脂重、腹脂重、皮脂率和腹脂率之间存在显著相关,且TT型显著优于GG型（P<0.05）。提示该位点对脂肪性状有显著影响。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 前言

1.2 候选基因分析方法

1.2.1 候选基因法分析的步骤

1.2.2 候选基因法的优缺点

1.3 标记辅助选择

1.4 脂肪性状的相关研究

1.4.1 调节脂肪细胞分化的相关因素

1.4.2 影响脂肪沉积的候选基因

1.5 单核苷酸多态性（SNP）及其特点

1.5.1 SNP 的基本概念及分类

1.5.2 SNP 的特点

1.6 本研究的目的意义

第二章北京鸭脂肪性状候选基因的克隆及生物信息学分析

2.1 材料

2.1.1 主要仪器

2.1.2 主要试剂

2.1.3 载体和菌株

2.1.4 组织样品

2.1.5 主要溶液配制

2.2 方法

2.2.1 总RNA 的提取

2.2.2 引物设计与合成

2.2.3 RT-PCR

2.2.4 PCR 产物的回收

2.2.5 连接

2.2.6 转化

2.2.7 菌落PCR

2.2.8 阳性克隆cDNA 片断测序及序列分析

2.3 结果与分析

2.3.1 组织中总RNA 的提取及检测

2.3.2 北京鸭ADRP 基因的克隆及生物信息学分析

2.3.3 北京鸭PPAR 基因的克隆及生物信息学分析

2.3.4 北京鸭IGF-Ⅰ基因的克隆及生物信息学分析

2.4 讨论

2.4.1 基因克隆方法

2.4.2 生物信息学分析

2.5 小结

第三章北京鸭脂肪性状候选基因的组织表达规律研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 试验方法

3.2 结果

3.2.1 ADRP 基因在不同组织中的表达规律

3.2.2 PPAR 基因在不同组织中的表达规律

3.2.3 IGF-Ⅰ基因在不同组织中的表达规律

3.3 讨论

3.3.1 组织表达规律研究方法

3.3.2 cDNA 模板

3.3.3 ADRP、PPAR 和IGF-Ⅰ基因在不同组织中的表达规律

3.4 小结

第四章北京鸭IGF-Ⅰ和PPAR 基因的原核表达

4.1 材料

4.1.1 主要仪器

4.1.2 主要试剂

4.1.3 载体及宿主菌

4.1.4 cDNA 模板

4.2 方法

4.2.1 引物设计

4.2.2 克隆载体的构建

4.2.3 原核表达载体的构建

4.2.4 重组蛋白的诱导表达

4.2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析

4.3 结果

4.3.1 克隆载体的构建

4.3.2 原核表达载体的构建

4.3.3 目的蛋白的诱导表达

4.3.4 Western Blotting 检测

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 IGF-Ⅰ和PPAR 基因遗传多样性与鸭脂肪性状的关联分析

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 方法

5.2 结果与分析

5.2.1 PPARα基因多态性及其与鸭胴体及脂肪性状的相关性分析

5.2.2 PPARγ基因多态性及其与鸭胴体及脂肪性状的相关性分析

5.2.3 IGF-Ⅰ基因多态性及其与鸭胴体及脂肪性状的相关性分析

5.3 讨论

5.3.1 SNP 的检测及群体遗传分析

5.3.2 关于PPARα、PPARγ和IGF-Ⅰ基因的遗传多样性

5.3.3 PPARγ基因多态性与鸭胴体及脂肪性状相关性分析

5.4 小结

第六章结论

6.1 主要结论

6.2 本研究的创新点

6.3 进一步研究内容

参考文献

缩略词

致谢

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