本文主要研究内容
作者王文骞（2019）在《表达IBDV-VP2新型重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价》一文中研究指出：乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是一类以乳酸为主要代谢产物的厌氧菌。早在几百年前,人们就利用乳酸菌生产酸奶等发酵食品,其安全特性已经被广泛认可。近年来,乳酸菌作为重组蛋白口服载体疫苗的潜力也备受关注。在过去的二十年中,许多乳酸菌菌株的生理学和遗传学特性已经被彻底地研究,一些菌株已经完成全基因组测序,并且开发出了多种基于乳酸乳球菌的遗传表达工具,其中NICE基因调控表达系统(Nisin-controlled gene expression system,NICE)就是一种简便、可控的表达系统,该系统通过纳克量级的nisin(来自乳酸菌自身的一种34个氨基酸的天然细菌素)即可激活并诱导目的基因的转录和表达,因此,该系统已被广泛应用于表达外源蛋白;此外,乳酸菌还有非诱导的组成型持续表达系统等。但是与相对成熟的酵母和大肠杆菌表达系统相比,乳酸菌表达系统普遍存在表达量不足、难以分泌等劣势,不利于重组乳酸菌的构建和外源目的蛋白的表达。本研究独创性地采用由NICE诱导表达系统和组成型持续表达系统组成的双启动子串联表达策略,构建了由单一质粒携带双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌,旨在弥补乳酸菌表达系统表达量不足的问题;并且在目的蛋白VP2羧基端融合了肠炎沙门氏菌侵袭蛋白RCK的黏附功能域多肽,旨在利用该蛋白多肽黏附入侵细胞的特性,增加抗原递呈细胞对目的蛋白的被动摄取,从而引起更强的免疫应答,弥补乳酸菌作为口服疫苗载体不能有效递送抗原的问题。本研究利用食品级乳酸乳球菌NZ3900作为宿主菌株,并在其配套的食品级NICE表达质粒pNZ8149的基础上,引入了由P45启动子组成的乳酸菌持续表达单元,构建了由单一质粒携带双启动子的串联表达载体,同时融合表达了传染性法氏囊病主要抗原蛋白VP2和沙门氏菌侵袭蛋白RCK的黏附功能域,成功构建了r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌;此外,我们还引入了pgsA跨膜蛋白的锚定结构域(用于外源蛋白的表面展示),成功构建了锚定展示重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK。体外检测结果显示:重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK成功表达了52 kD大小的融合蛋白,与预期结果一致,且融合蛋白表达量可达160μg/mL。重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK成功表达了95 kD大小的融合蛋白,与预期结果吻合,并且经表面蛋白提取、间接免疫荧光和流式细胞分析证明了融合蛋白部分表达并展示于细胞表面。动物实验结果显示:口服10~9 CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK,一免一周和二免一周后,血清IBDV-ELISA抗体(IDEXX全病毒包被ELISA及VP2包被ELISA)全部为阴性,中和抗体滴度为0;攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒之后,仅有60%的免疫鸡存活,存活鸡的法氏囊有不同程度的损伤。注射10~9 CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK,一免一周和一免两周后,血清IBDV-ELISA抗体也全部为阴性,但中和抗体滴度在一免一周和一免两周后分别可以达到2~6和2~8;攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒之后,免疫鸡100%存活,且法氏囊基本不受损害。口服10~9 CFU重组乳酸菌r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK,一免一周和二免一周后,血清IBDV-ELISA抗体全部为阴性,中和抗体滴度为0;一免两周后攻毒1000个ELD50的IBDV-HLJ0504超强毒,该实验组的免疫攻毒保护率仅为50%,且存活鸡法氏囊损伤严重。本研究构建的由单一质粒携带双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌,能够同时由双启动子串联表达VP2-RCK融合蛋白,表达量可达到160 mg/L以上。动物实验结果说明:注射r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌可引起机体产生有效的免疫应答,仅一次免疫即可产生高水平的中和抗体,能够抵抗IBDV超强毒的攻击,产生100%的保护率。双启动子串联表达同一目的蛋白的新型重组乳酸菌为重组乳酸菌活载体疫苗的开发和应用奠定了基础,为新型黏膜疫苗的研究提供了全新的工具。
Abstract
ru suan jun (Lactic Acid Bacteria,LAB)shi yi lei yi ru suan wei zhu yao dai xie chan wu de ya yang jun 。zao zai ji bai nian qian ,ren men jiu li yong ru suan jun sheng chan suan nai deng fa jiao shi pin ,ji an quan te xing yi jing bei an fan ren ke 。jin nian lai ,ru suan jun zuo wei chong zu dan bai kou fu zai ti yi miao de qian li ye bei shou guan zhu 。zai guo qu de er shi nian zhong ,hu duo ru suan jun jun zhu de sheng li xue he wei chuan xue te xing yi jing bei che de de yan jiu ,yi xie jun zhu yi jing wan cheng quan ji yin zu ce xu ,bing ju kai fa chu le duo chong ji yu ru suan ru qiu jun de wei chuan biao da gong ju ,ji zhong NICEji yin diao kong biao da ji tong (Nisin-controlled gene expression system,NICE)jiu shi yi chong jian bian 、ke kong de biao da ji tong ,gai ji tong tong guo na ke liang ji de nisin(lai zi ru suan jun zi shen de yi chong 34ge an ji suan de tian ran xi jun su )ji ke ji huo bing you dao mu de ji yin de zhuai lu he biao da ,yin ci ,gai ji tong yi bei an fan ying yong yu biao da wai yuan dan bai ;ci wai ,ru suan jun hai you fei you dao de zu cheng xing chi xu biao da ji tong deng 。dan shi yu xiang dui cheng shou de jiao mu he da chang gan jun biao da ji tong xiang bi ,ru suan jun biao da ji tong pu bian cun zai biao da liang bu zu 、nan yi fen bi deng lie shi ,bu li yu chong zu ru suan jun de gou jian he wai yuan mu de dan bai de biao da 。ben yan jiu du chuang xing de cai yong you NICEyou dao biao da ji tong he zu cheng xing chi xu biao da ji tong zu cheng de shuang qi dong zi chuan lian biao da ce lve ,gou jian le you chan yi zhi li xie dai shuang qi dong zi chuan lian biao da tong yi mu de dan bai de xin xing chong zu ru suan jun ,zhi zai mi bu ru suan jun biao da ji tong biao da liang bu zu de wen ti ;bing ju zai mu de dan bai VP2suo ji duan rong ge le chang yan sha men shi jun qin xi dan bai RCKde nian fu gong neng yu duo tai ,zhi zai li yong gai dan bai duo tai nian fu ru qin xi bao de te xing ,zeng jia kang yuan di cheng xi bao dui mu de dan bai de bei dong she qu ,cong er yin qi geng jiang de mian yi ying da ,mi bu ru suan jun zuo wei kou fu yi miao zai ti bu neng you xiao di song kang yuan de wen ti 。ben yan jiu li yong shi pin ji ru suan ru qiu jun NZ3900zuo wei su zhu jun zhu ,bing zai ji pei tao de shi pin ji NICEbiao da zhi li pNZ8149de ji chu shang ,yin ru le you P45qi dong zi zu cheng de ru suan jun chi xu biao da chan yuan ,gou jian le you chan yi zhi li xie dai shuang qi dong zi de chuan lian biao da zai ti ,tong shi rong ge biao da le chuan ran xing fa shi nang bing zhu yao kang yuan dan bai VP2he sha men shi jun qin xi dan bai RCKde nian fu gong neng yu ,cheng gong gou jian le r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCKchong zu ru suan jun ;ci wai ,wo men hai yin ru le pgsAkua mo dan bai de mao ding jie gou yu (yong yu wai yuan dan bai de biao mian zhan shi ),cheng gong gou jian le mao ding zhan shi chong zu ru suan jun r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK。ti wai jian ce jie guo xian shi :chong zu ru suan jun r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCKcheng gong biao da le 52 kDda xiao de rong ge dan bai ,yu yu ji jie guo yi zhi ,ju rong ge dan bai biao da liang ke da 160μg/mL。chong zu ru suan jun r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCKcheng gong biao da le 95 kDda xiao de rong ge dan bai ,yu yu ji jie guo wen ge ,bing ju jing biao mian dan bai di qu 、jian jie mian yi ying guang he liu shi xi bao fen xi zheng ming le rong ge dan bai bu fen biao da bing zhan shi yu xi bao biao mian 。dong wu shi yan jie guo xian shi :kou fu 10~9 CFUchong zu ru suan jun r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK,yi mian yi zhou he er mian yi zhou hou ,xie qing IBDV-ELISAkang ti (IDEXXquan bing du bao bei ELISAji VP2bao bei ELISA)quan bu wei yin xing ,zhong he kang ti di du wei 0;gong du 1000ge ELD50de IBDV-HLJ0504chao jiang du zhi hou ,jin you 60%de mian yi ji cun huo ,cun huo ji de fa shi nang you bu tong cheng du de sun shang 。zhu she 10~9 CFUchong zu ru suan jun r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK,yi mian yi zhou he yi mian liang zhou hou ,xie qing 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chan sheng you xiao de mian yi ying da ,jin yi ci mian yi ji ke chan sheng gao shui ping de zhong he kang ti ,neng gou di kang IBDVchao jiang du de gong ji ,chan sheng 100%de bao hu lv 。shuang qi dong zi chuan lian biao da tong yi mu de dan bai de xin xing chong zu ru suan jun wei chong zu ru suan jun huo zai ti yi miao de kai fa he ying yong dian ding le ji chu ,wei xin xing nian mo yi miao de yan jiu di gong le quan xin de gong ju 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国农业科学院的王文骞，发表于刊物中国农业科学院2019-07-05论文，是一篇关于重组乳酸菌论文,蛋白论文,传染性法氏囊病病毒论文,蛋白论文,中国农业科学院2019-07-05论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国农业科学院2019-07-05论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。