人肠道微生态恒化器模拟系统建立

论文摘要

残留在动物可食性组织中的抗菌药物被人体摄入后,可能对人体肠道菌群产生诸多不良影响,如选择出耐药的肠道菌群或使肠道细菌耐药性增强,破坏肠道菌群的屏障作用,改变肠道菌群代谢活性等,从而对人类健康构成巨大威胁。在国际上,抗菌药残留对人体肠道菌群影响的安全性评价研究日渐成为热点。但国内由于缺乏被国际组织普遍认可的评价模型,该领域的研究工作进展缓慢。本研究利用细菌连续培养的恒化器原理,通过对稀释率和转入连续培养时间两方面条件的摸索和优化,建立了人肠道微生态恒化器模拟系统。该模拟系统是国际组织推荐的两大类模型之一,其建立将会促进国内外该领域的研究,对保障人类食品和医学安全具有极其重要的意义。本研究选用拟杆菌—胆汁—七叶苷琼脂培养基、BBL琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基和肠球菌选择性培养基,分别分离计数人粪便中四种优势代表菌（脆弱拟杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和肠球菌）。建立粪便中三种主要短链脂肪酸（SCFA,即乙酸、丙酸和丁酸）浓度测定的气相色谱方法。将50mL（20%）的新鲜粪便悬液接种于发酵罐中,厌氧条件下分批培养,定时取样,采用平板稀释计数法记录培养液中四种优势代表菌的数目,绘制其分批培养的菌体生长曲线,计算对数生长期。在此基础上,以培养液中四种优势代表菌数目和三种主要的短链脂肪酸浓度为监测指标,优化连续培养工艺,包括稀释率(0.05h-1、0.07h-1和0.09h-1)和转入连续培养的时间（第5h、第7h和第9h）,建立人肠道微生态恒化器模拟系统。在优化后的培养条件下进行为期30 d的试验,进一步评价所建立的模拟系统的稳定性和可靠性。分批培养显示,四种优势菌的对数生长期不尽相同,但都包含了第3-8h。在0.07h-1的条件下,系统在连续培养的前14d达到了稳态,因此0.07h-1为相对较合适的稀释率。第7h转入连续培养时,系统较其他两个条件更早达到了稳态,且稳态时系统中的菌群数量和SCFA浓度也最高,因此第7h为相对较合适的转入连续培养的时间。30d试验显示,在第9-30d的系统中,四种代表菌的数量和三种SCFA的浓度变化差异均不显著,系统培养条件（如温度、搅拌速度、pH值等）的稳定性也较好。模拟系统在达到稳态后,其培养体系中的四种优势菌数量和三种SCFA浓度与接种前的粪便相比略有下降,但均在报道的健康人正常的生理参数范围内。上述试验结果表明,本研究通过对稀释率和转入连续培养时间等条件的摸索和优化,成功建立了人肠道微生态恒化器模拟系统,系统具有较好的稳定性和可靠性,能够模拟健康人的肠道微生态环境。本研究首次从菌群数量和代谢物浓度两个角度较全面地对恒化器模拟系统的稳定性、可靠性进行了评价,填补了国内研究的空白。本研究还解决了目前国内外建立同类模拟系统时存在的搅拌不均匀、液位不稳定、操作复杂而导致模拟系统相对不够稳定等问题。该恒化器模拟系统的建立可以为抗菌药残留对人肠道菌群影响的安全性评价研究构建平台,也可为新药、功能食品等的安全评价研究及药物代谢研究提供更科学的方法和途径,对保障人类食品和医学安全、促进相关学科发展具有极其重要的意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 立题依据
• 1.2 国内外研究进展
• 1.3 研究内容、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 仪器设备
• 2.2 标准菌株
• 2.3 培养基和试剂
• 2.3.1 细菌计数用培养基和试剂
• 2.3.2 短链脂肪酸标准品和试剂
• 2.3.3 肠道菌群培养用培养基
• 2.4 粪样中细菌的分离鉴定
• 2.5 粪样中短链脂肪酸检测方法
• 2.6 肠道菌群的分批培养
• 2.7 组建恒化器模拟系统
• 2.8 恒化器模拟系统的运行
• 2.9 样品测定方法及统计学分析
• 2.10 稀释率的优化
• 2.11 转入连续培养时间的优化
• 2.12 恒化器模拟系统的稳定性考察
• 3 结果与分析
• 3.1 细菌分离鉴定
• 3.1.1 大肠杆菌分离鉴定
• 3.1.2 肠球菌分离鉴定
• 3.1.3 双歧杆菌分离鉴定
• 3.1.4 脆弱拟杆菌分离鉴定
• 3.2 粪样中短链脂肪酸检测方法的建立
• 3.3 肠道菌群分批培养生长曲线的测定
• 3.4 不同稀释率对连续培养菌群的影响
• -1的稀释率对连续培养菌群的影响'>3.4.1 0.05h^-1的稀释率对连续培养菌群的影响
• -1的稀释率对连续培养菌群的影响'>3.4.2 0.07h^-1的稀释率对连续培养菌群的影响
• -1的稀释率对连续培养菌群的影响'>3.4.3 0.09h^-1的稀释率对连续培养菌群的影响
• 3.5 不同转入连续培养的时间对连续培养菌群的影响
• 3.5.1 第5h转入时对连续培养菌群的影响
• 3.5.2 第7h转入时对连续培养菌群的影响
• 3.5.3 第9h转入时对连续培养菌群的影响
• 3.6 恒化器模拟系统的稳定性
• 3.7 稳态模拟系统中指标的评价
• 4 讨论
• 4.1 模拟系统评价指标的选择
• 4.2 试验设计
• 4.3 恒化器模拟系统的建立
• 4.3.1 不同稀释率对模拟系统中菌群的影响
• 4.3.2 不同转入连续培养的时间对菌群的影响
• 4.3.3 恒化器模拟系统最终培养条件的确定
• 4.4 恒化器模拟系统评价
• 4.4.1 模拟系统稳定性
• 4.4.2 模拟系统可靠性
• 4.4.3 模拟系统优缺点
• 5 小结
• 文献综述:兽用抗生素耐药性检测方法研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 对答辩委员提问的回答