新诊断急性粒细胞白血病剪接因子异常表达研究

论文摘要

背景：选择性剪接是指细胞选择性地对前mRNA剪接位点的组合剪接加工，形成不同的成熟mRNA，从而使一个基因产生若干具有独特结构和功能的蛋白异构体的过程。最近研究报道，多达94%的人类基因都发生了选择性剪接，并且该过程的异常与肿瘤的发生、发展密切相关。大量研究显示，急性粒细胞白血病（AML）患者体内普遍存在着异常的选择性剪接，并且这可能是AML发生、发展的关键分子基础。目前认为，AML中大量存在的异常剪接事件可能与患者体内剪接调控因子发生的显著变化密切相关。最近关于剪接调控因子的研究有很多，但遗憾的是到目前为止，还没有相关的研究关注AML患者体内剪接调控因子的表达情况。另外，caspase-8是一种关键的凋亡相关蛋白水解酶，在选择性剪接作用下，caspase-8pre-mRNA至少可以产生7种不同的成熟mRNA，进而编码出相应的蛋白质异构体发挥各自不同的生物学作用。已有研究报道，caspase-8在AML中存在异常的剪接行为，并且这与白血病细胞的抗凋亡密切相关。本研究拟用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测新诊断AML患者体内8个剪接调控因子[7个SR蛋白家族成员和1个主要的剪接负调节蛋白，即SRSF1（SF2/ASF），SRSF2（SC35），SRSF3（SRp20），SRSF4（SRp75），SRSF5（SRp40），SRSF6（SRp55）， SRSF7（9G8）和hnRNPA1] mRNA水平的变化，以观察各种剪接因子的特异性变化规律，探讨应用qRT-PCR方法检测剪接调控因子表达水平在AML诊断、预后和治疗中的潜在意义。另一方面拟运用凝胶电泳检测AML中CASP8的剪接模式，并统计分析剪接因子mRNA水平的变化与CASP8剪接模式的潜在关系，以初步探讨AML中CASP8发生异常剪接的机制，及其在AML治疗中潜在的价值。方法：共采集26例新诊断AML患者和26例健康对照者外周血标本，分离单个核细胞后提取总RNA，运用qRT-PCR方法检测8个剪接调控因子mRNA相对表达量。同时，运用凝胶电泳检测CASP8的剪接模式，统计分析各剪接因子的特异性变化规律，CASP8剪接模式的变化及剪接因子表达量与CASP8剪接模式的潜在关系。结果：1.与健康对照组相比，新诊断AML患者体内剪接因子的表达发生了显著改变，SRSF1，SRSF3和SRSF4mRNA表达量减低；SRSF1/HNRNPA1比值和SRSF1/SRSF3比值也减低，差异均有统计学意义。2. AML中CASP8的剪接模式不同于健康对照组，CASP8L在AML中表达较高，CASP8A在对照组中表达较高，AML中CASP8L/CASP8A比值高于健康对照组，差异均有统计学意义。3.在AML中，SRSF3和CASP8L，SRSF3和CASP8L/CASP8A比值，SRSF4和CASP8L之间有显著相关性，对照组中未发现该相关性。结论：1.新诊断AML患者体内多种剪接因子的表达失调，并且这种异常表达可能与某些肿瘤相关基因的异常剪接相关，这可能是间接导致AML发生的关键事件之一。2.肿瘤中SR蛋白家族成员的表达水平具有肿瘤特异性，在不同的肿瘤或同种肿瘤的不同阶段，其表达情况亦不同，多种剪接因子在新诊断AML中表达异常，这些剪接因子可能在AML的早期诊断、预后和治疗等方面有潜在的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 临床标本
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 主要试剂配置方法
• 2.2.2 引物的设计与合成
• 2.2.3 单个核细胞的提取与保存
• 2.2.4 总 RNA 的提取
• 2.2.5 cDNA 的合成
• 2.2.6 CASP8 剪接模式检测
• 2.2.7 荧光定量 PCR 检测
• 2.2.8 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 外周血单个核细胞中总 RNA 的提取
• 3.2 新诊断 AML 剪接因子 mRNA 表达水平分析
• 3.3 新诊断 AML CASP8 剪接模式分析
• 3.4 CASP8 剪接模式与剪接因子 mRNA 表达水平关系分析
• 3.5 正常人 BMMCs 和 PBMCs 中剪接因子表达分析
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献