论文摘要
目的：1、构建HPV16E7基因转染角质形成细胞系,将该细胞系作为观察ALA-PDT对HPV感染角质形成细胞凋亡途径影响的研究模型。2、探讨HPV感染角质形成细胞的最佳ALA孵育时间和ALA光动力诊断（photodynamic diagnosis, PDD）诊断HPV感染性疾病的实验数据。3、研究ALA-PDT对HPV感染角质形成细胞杀伤的作用机制,明确ALA-PDT诱导HPV感染角质形成细胞的凋亡通路,进一步将ALA-PDT推广应用于治疗HPV携带者和亚临床感染与潜伏感染的患者。方法：1、利用RT-PCR技术扩增出CaSki细胞中的HPV16E7基因.再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）/HPV16E7,将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株；利用cck8检测HaCaT/E7细胞的生长曲线；应用光学显微镜观察HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三种细胞形态。2、最适ALA浓度1mM（前期实验结果）孵育HPV感染角质形成细胞后,采用Biotek酶标仪检测连续八小时内的HaCaT/E7细胞PpIX荧光强度,得出HPV感染角质形成细胞的最佳ALA孵育时间和ALA光动力诊断（photodynamic diagnosis, PDD）用于诊断HPV感染性疾病的最佳时间点。3、在最佳ALA孵育时间（Optimal time）点,采用磷脂结合蛋白Ⅴ （Annexin Ⅴ）/碘化丙锭（PI）双染法通过流式细胞术检测同一剂量（8J/cm2） ALA-PDT后不同时间点（连续8个小时）,以及不同剂量（OJ/cm2,4J/cm2,8J/cm2,10J/cm2,12J/cm2,16J/cm2和20J/cm2） ALA-PDT后同一时间点（3小时）对HaCaT/E7细胞凋亡及坏死的比例。4、采用阳离子脂质荧光探针JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethy-benzimi dazol-carbocyanine iodide,四氯四乙基苯并咪唑羰花青）检测ALA-PDT前后HaCaT/E7细胞株线粒体跨膜电位的变化。5、利用western blot技术研究ALA-PDT对HaCaT/E7细胞cytichrome c和Caspase9/3表达的影响。6、半定量逆转录酶-多聚酶链式反应及Real time PCR检测ALA-PDT对HaCaT/E7细胞凋亡基因Caspase9、.3mRNA表达的调控。结果：1.成功构建了稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株：Western blotting检测可见E7蛋白条带,巢式RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297bp条带,HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三种细胞形态无明显改变,HaCaT/E7细胞呈现明显生长优势。2.ALA处理培养细胞及原卟啉Ⅸ （PpⅨ）荧光动力学研究：HaCaT, HaCaT/E7和HaCaT/pcDNA3.1三组细胞的PpⅨ峰值时间均为5小时,3小时与对照组相比出现明显增高,有统计学意义（P<0.05）,HaCaT/E7组的PpⅨ荧光强度普遍高于对照HaCaT组,HaCaT/pcDNA3.1组荧光强度呈现最高；一小时三组细胞PpⅨ荧光强度呈现显著性统计学差异（P<0.05）。3. Annexin V/PI双染法流式细胞术检测HaCaT/HPV16E7细胞凋亡百分率显示：同一时间ALA-PDT后3小时,随着光剂量的增加,HaCaT/E7细胞的的凋亡和坏死明显增加,小剂量以凋亡为主,大剂量以坏死为主；同一剂量8J/cm2的照射剂量ALA-PDT后,HaCaT/E7细胞在连续8个小时内凋亡和坏死总量不断增加。4.阳离子脂质荧光探针JC-1显示：ALA-PDT后HaCaT/HPV16E7细胞株线粒体跨膜电位崩塌细胞比例明显增加,随着剂量和时间增加,这种细胞比例逐步增多,呈一定的剂量和时间依赖性,共聚焦显微镜下可见随着ALA-PDT后时间延长,细胞形态发生明显改变,显示线粒体跨膜电位下降的发生早于形态学改变,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。5.半定量比较western blotting结果显示：HaCaT/HPV16E7细胞ALA-PDT后Caspase-3、Caspase-9及活化片段蛋白表达量明显上调,在从8J/cm2照射剂量和治疗后3小时达到高峰。6. Real time RT-PCR均显示：ALA-PDT对HaCaT/HPV16E7细胞内Caspase-3、 Caspase-9的基因表达量无明显影响,统计学无明显差异（P>0.05）。结论：1.成功构建了HPV16E7转染角质形成细胞的模型,为目前尚缺乏HPV感染动物模型情况下,提供新的研究思路和寻求新的研究技术。2.通过对细胞原卟啉Ⅸ的研究,从细胞学水平上辅助证明了临床上用于光动力治疗HPV感染性疾病的的最佳封包时间为3-5小时,而用于光动力诊断时间可为1小时。3.ALA光动力诱导HPV感染细胞以坏死和凋亡两种方式引起死亡,小剂量的光动力主要以凋亡为主,而大剂量的光动力以坏死为主,呈一定的时间依赖性。4.ALA介导的PDT诱导的细胞凋亡可改变线粒体膜电位,膜电位的改变早于细胞形态和磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面,提示凋亡与线粒体的结构和功能有关。5. ALA-PDT可上调HaCaT/HPV16E7细胞中Caspase-9、Caspase-3活化片段蛋白表达量,证明其诱导HPV感染角质形成细胞的凋亡途径主要通过线粒体途径。6. ALA-PDT对HaCaT/HPV16E7细胞内Caspase-3、Caspase-9的基因表达量无明显影响,显示其介导的线粒体凋亡途径发挥可能未通过基因水平而仅在蛋白质水平。
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