微分离分析新方法研究

论文摘要

分析体系的微型化是现代分析化学发展的一个重要方向。为了提高分析的灵敏度和通量，满足现场实时分析的需要，降低分析成本和样品消耗量，发展微量化、集成化的分析方法已成为当前研究的前沿领域。微流控芯片技术是上世纪九十年代初发展起来的一门新兴技术，因其具有样品消耗小、分析速度快、易实现阵列化和集成化的优点而吸引了研究者的广泛关注，成为微型化分析领域中的研究热点。本论文的研究目的，一是要拓展基于微流控电泳芯片的新分离方法，二是要为实现微流控集成化分析提供基础。围绕这两个目的，本论文主要进行了基于微流控芯片电泳的多维分离方法研究和基于毛细管的样品预处理、分离和检测集成化分析方法研究，全文共分五章，主要内容如下：第一章为文献综述，详细介绍了微分析技术的现状和发展趋势。从微通道分离、检测和样品预处理等方面展开综述，介绍了毛细管液相色谱和毛细管电泳两大微分离手段以及微通道多维分离方法，概述了能够用于微通道检测的激光诱导荧光（LIF）、电化学和质谱（MS）等多种检测技术，总结了微通道中的样品纯化、富集和衍生等预处理方法。最后，阐述了本论文的研究背景和选题意义。第二章首次建立了毛细管液相色谱和微流控芯片电泳联用的新型二维分离系统。多维分离是增强分离体系峰容量的强有力手段，本研究的创新之处，就是将微流控芯片电泳应用到液相色谱和电泳联用的二维分离模式中，既发挥了毛细管液相色谱和芯片电泳各自的分离优势，又解决了接口制作的难题。通过芯片上的小孔，第一维的液相色谱毛细管柱可以直接与芯片相连，第一维的分离产物连续进入芯片，依靠芯片上的交叉通道和电压切换实现第二维的进样。该系统结合了毛细管液相色谱高效分离的优点和微流控芯片电泳快速分离的特性，巧妙地利用了微流控芯片的交叉通道和电控进样方式，具有接口制作简单、死体积小、操作便利、峰容量高的优点。本章详细描述了该二维系统的构建方法，对两维连接的实验参数进行了考察，获得了蛋白质酶解产物的全二维分离谱图。第三章发展了针对兴奋剂的毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测（LIF）方法。兴奋剂的检测是微流控芯片分析技术的重要应用领域。在兴奋剂问题日益突出的今天，发展快速、微型化、自动化的兴奋剂检测新方法具有重要意义。在微流控芯片上实现尿样中兴奋剂的样品预处理、分离和检测集成化分析，将为实现兴奋剂的高通量和高灵敏度检测提供新的途径。毛细管具有与芯片微通道相近的内径尺寸，因此，基于毛细管的兴奋剂分析方法是通往芯片集成化分析的桥梁和必经之路。本研究的创新之处，就是针对将来芯片上的检测要求，发展了高灵敏度的LIF直接检测法和间接检测法，为芯片微通道里的刺激剂和利尿剂检测提供了依据。在本章中，首先建立了LIF直接检测的一般方法，构建了包括自动进样器、分离毛细管和LIF检测器的电泳分离／检测体系，在此基础上，建立了针对麻黄碱类刺激剂的直接LIF检测方法。以荧光素异硫氰酸酯（FITC）为荧光衍生试剂，研究了麻黄碱、庚胺醇、去甲基伪麻黄碱等刺激剂的荧光衍生条件和毛细管电泳分离条件。由于直接检测法对样品结构有一定要求，在寻求不到合适的衍生试剂时，间接检测法作为一种通用检测方法显示出了其优越性。本章对用于间接LIF检测的多种电泳缓冲体系进行了考察，建立了以三乙胺／荧光素／正丁醇为缓冲体系的间接检测方法，对尿液中的四种酸性利尿剂（依他尼酸、氯噻酮、布美它尼和苄氟噻嗪）进行了分析。第四章发展了毛细管柱内的样品预处理方法，主要是微通道固相萃取和固相衍生方法，并将之应用于尿样中麻黄碱类刺激剂的预处理。本章的创新之处在于：1)，实现了微通道中固相载体的定位。本章采用紫外光照聚合与匀浆填充法相结合的方法，在微通道中的任意位置制备了用于样品预处理的，长度可控的固相载体，制备方法简便易行，无需采用复杂的微加工技术，为将来集成化芯片微通道中固相载体的定位提供了基础。2)，提出了微通道中的多相载体技术，以此获得较高的固相萃取和固相衍生效率。本章将多孔聚合物整体床与色谱填料相结合，制备了多孔聚合物单相柱、多孔聚合物／ODS双相柱和多孔聚合物／GDX-502双相柱等三种类型的毛细管预处理柱，对低浓度的麻黄碱进行了预处理，结果表明双相柱的预处理结果要优于单相柱。3)，发展了固相衍生技术，不仅获得了优于溶液衍生的衍生效果，同时也使固相萃取步骤与衍生步骤顺利衔接，为微通道中的高效衍生提供了新的途径。4)，首次提出了微波辅助固相衍生方法，将高效的固相反应与快速的微波辅助反应相结合，使FITC的衍生反应由十几小时缩短至几分钟，大大提高了样品预处理的速度。围绕样品的纯化、富集和衍生，本章探讨了不同类型的预柱对简单背景（水溶液）和复杂背景（尿样）中麻黄碱的预处理方法，确定了以多孔聚合物／GDX-502双相柱对尿液中的麻黄碱进行预处理的最终技术路线。结果表明，该固相萃取和固相衍生方法能够很好地匹配后续毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测，可检出尿样中10ng的麻黄碱。该研究为将来兴奋剂的集成化微流控芯片分析奠定了基础。第五章对基于毛细管柱的蛋白质固相测序新方法进行了初步研究。蛋白质的氨基酸排列顺序一直是生命科学研究的重要内容，在蛋白组学研究蓬勃发展的今天，尤其需要发展多种技术平台，对微量蛋白质进行准确、快速和灵敏的序列分析。现有的蛋白质测序方法中，最为成熟并广泛应用的是Edman氮端降解测序法。本章的主要工作就是探讨Edman降解测序法在微通道中实现的可能性，将包括多个反应步骤的常规测序方法微型化，为将来在微流控芯片中实现Edman降解测序集成化方法提供基础。为了实现微通道里的高灵敏度检测，本研究对经典Edman降解方法进行了改进，探索了以荧光试剂FITC为偶联剂的降解反应。本章详细讨论了该微分析方法的实施策略，初步确定了从微量蛋白质的固定到转化产物LIF检测的技术路线，为进一步的测序工作奠定了基础。综上所述，本论文立足于发展微流量，乃至纳流量尺度上的分离分析新方法，从样品预处理、色谱／电泳分离和激光诱导荧光检测等方面展开工作，建立了微型二维分离体系以及兴奋剂的微通道集成化分析方法，并对微通道中的蛋白质固相测序方法进行了初步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 微通道分离技术
• 1.1.1 毛细管液相色谱分离技术
• 1.1.2 毛细管电泳分离技术
• 1.1.3 微通道多维分离技术
• 1.2 微通道检测技术
• 1.2.1 光学检测技术
• 1.2.2 电化学检测技术
• 1.2.3 质谱检测技术
• 1.3 微通道样品预处理技术
• 1.3.1 样品纯化技术
• 1.3.2 样品富集技术
• 1.3.3 微通道反应器
• 1.4 本论文研究思路
• 参考文献
• 第二章 毛细管液相色谱与微流控芯片电泳联用的二维分离系统
• 2.1 实验装置
• 2.1.1 试剂和样品准备
• 2.1.2 微流控芯片的设计和加工
• 2.1.3 毛细管液相色谱柱的制备
• 2.1.4 毛细管液相色谱柱与电泳芯片的联用
• 2.1.5 激光诱导荧光检测器
• 2.2 芯片电泳的实现
• 2.2.1 芯片上的微流体操控
• 2.2.2 芯片电泳分离
• 2.3 二维联用模式
• 2.3.1 芯片上的样品转移接口
• 2.3.2 二维操控参数的选择
• 2.4 肽段的二维分离
• 2.5 体系的评价
• 2.5.1 体系的峰容量
• 2.5.2 二维分离接口的重现性
• 2.5.3 体系的重复性
• 2.6 总结
• 参考文献
• 第三章 兴奋剂的激光诱导荧光检测新方法
• 3.1 LIF直接检测一般方法
• 3.1.1 分离检测体系的构建
• 3.1.2 荧光试剂的选择
• 3.1.3 直接检测方法的一般评价
• 3.2 刺激剂的 CZE-LIF分析法
• 3.2.1 试剂和样品
• 3.2.2 刺激剂的衍生和分离
• 3.2.3 衍生条件的优化
• 3.2.4 电泳分离条件的优化
• 3.2.5 尿样中刺激剂的分离分析
• 3.2.6 小结
• 3.3 刺激剂的 MEKC-LIF分析法
• 3.3.1 FITC衍生产物的分离
• 3.3.2 NBD-F衍生产物的分离
• 3.3.3 小结
• 3.4 LIF间接检测一般方法
• 3.4.1 间接检测的理论基础
• 3.4.2 电泳缓冲体系的选择
• 3.4.3 小结
• 3.5 利尿剂的 CZE-间接 LIF检测方法
• 3.5.1 试剂和样品预处理
• 3.5.2 电泳分离和间接检测
• 3.5.3 缓冲体系的优化
• 3.5.4 间接检测方法的确认
• 3.5.5 尿样中利尿剂的分析
• 3.5.6 小结
• 3.6 总结
• 参考文献
• 第四章 毛细管柱内的兴奋剂样品预处理方法
• 4.1 实验装置
• 4.1.1 仪器和试剂
• 4.1.2 新型毛细管预处理柱的制备
• 4.1.3 样品的固相萃取
• 4.1.4 样品的荧光衍生
• 4.1.5 样品的检测
• 4.2 新型预处理柱的制备方法
• 4.2.1 多孔聚合物单相柱
• 4.2.2 多孔聚合物/ODS双相柱
• 4.2.3 多孔聚合物/高分子多孔微球双相柱
• 4.2.4 小结
• 4.3 多孔聚合物单相柱的固相萃取和固相衍生
• 4.3.1 单相柱的样品负载量
• 4.3.2 单相柱对麻黄碱的萃取条件优化
• 4.3.3 单相柱的固相衍生
• 4.3.4 小结
• 4.4 ODS双相柱的固相衍生
• 4.4.1 ODS双相柱对标准溶液的固相衍生
• 4.4.2 ODS双相柱对尿液中麻黄碱的固相衍生
• 4.4.3 ODS预柱双柱预处理
• 4.4.4 小结
• 4.5 高分子多孔微球双相柱的固相衍生
• 4.5.1 填料的选择
• 4.5.2 GDX-502预柱对尿液的预处理策略
• 4.6 微波辅助固相衍生技术
• 4.6.1 微波辅助溶液衍生
• 4.6.2 固相衍生与溶液衍生
• 4.6.3 微波辅助固相衍生
• 4.6.4 小结
• 4.7 总结
• 参考文献
• 第五章 毛细管内蛋白质固相测序方法初步研究
• 5.1 实验原理
• 5.1.1 经典 Edman降解法固相测序原理
• 5.1.2 本研究的设计思路
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 固相微反应柱的制备
• 5.2.3 不同方式的实施过程
• 5.2.4 电泳分离和 LIF检测
• 5.3 FITC偶联降解法
• 5.4 技术路线的确立
• 5.4.1 蛋白质的柱内固定
• 5.4.2 FITC的柱内和柱外偶联
• 5.4.3 转化产物的预处理
• 5.5 检测的灵敏度
• 5.6 降解的循环次数
• 5.7 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢