论文题目: 固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运基因的功能鉴定及表达调控研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 李红权
导师: 林敏
关键词: 斯氏假单胞菌,基因,突变,表达,调控
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501是一株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌,具有固氮和分泌植物激素等优良特性,但由于其碳源供应不足,联合固氮效率不稳定,在农业生产中的应用潜力受到极大的限制。本研究采用生物信息学、分子生物学等技术手段,以斯氏假单胞菌A1501四碳二羧酸转运（Dct）系统为研究对象,构建了四碳二羧酸转运调节基因dctBD和结构基因dctPQM的突变株和融合表达载体、开展了较为系统的生物学功能和表达调控研究,为通过基因工程途径改造四碳二羧酸转运系统,提高联合固氮效率奠定理论基础。 为研究四碳二羧酸转运相关基因的生物学功能,首先构建了携带功能完整的dctB基因片段、可互补dctB位点突变的广宿主质粒pLL2922,部分恢复了突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力。在琥珀酸、延胡索酸或苹果酸为唯一碳源的培养基上,携带功能完整dctB的质粒pLL2922能提高野生型菌株固氮活性28.9%,22.7%,15.6%。采用自杀性质粒pK18mob,构建了斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运结构基因dctP的极性突变株与非极性突变株,dctP的极性突变株使得其下游的dctQ与dctM基因失活,突变株均不能利用琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸进行生长和固氮作用。采用插入突变技术构建了斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运结构基因dctM突变株,在以苹果酸,延胡索酸,琥珀酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基上突变株不能生长,而野生型生长良好。固氮酶的结构基因nifH—lacZ融合表达载体在dctP的极性突变株与非极性突变株、dctM突变株中较野生型菌株中的表达量大大降低,在以琥珀酸、苹果酸或延胡索酸为唯一碳源的培养基上测定的半乳糖苷酶活力最高仅为野生型菌株中的17.0%,23.3%,24.9%。表明斯氏假单胞菌的dct基因在四碳二羧酸转运和高效固氮均具有重要作用。 通过功能互补、RT—PCR和融合基因表达等,开展了固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运dct基因的表达调控研究。构建了dctP基因启动区-lacZ融合基因表达载体,将其分别转入dctB突变株、σ54因子突变株或ntrBC突变株中,通过测定半乳糖苷酶活性,检测dctP启动子的表达活性,结果表明:dctP启动子为σ54依赖型启动子,其表达需要DctB、NtrB或NtrC等因子。葡萄糖抑制dctP基因表达水平,四碳二羧酸诱导dctP基因的表达,苹果酸的诱导水平高于琥珀酸、延胡索酸,表明dctP基因启动子为诱导型启动子。包含dctP启动子区及完整的dctPQM的片段的质粒可以互补dctM的突变,而不包含dctP启动子区仅包含dctQM的片段,不能互补dctM的突变,表明dctPQM共用一个启动子。RT—PCR实验结果发现,dctP与dctQ在dctB突变株A1701中的表达量明显低于野生型A1501,仅为野生型表达量的13.8%,17.7%,进一步验证了dctP启动子表达需要调节因子DctB。构建了dctB基因启动区-lacZ融合基因表达载体,诱导实验结果表明dctB为低水平组成型表达。 实验结果结合生物信息学分析表明,固氮斯氏假单胞菌的四碳二羧酸转运（Dct）系统由两个操纵子构成,dctBD是调节基因,dctPQM是结构基因。四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码,DctP不含跨膜区,DctQ和DctM含跨膜区,负责四碳二羧酸的跨膜转运。DctB为跨膜蛋白,感应外界四碳二羧酸信号,激活DctD,活化的DctD蛋白与σ54协同启动dctPQM基因的表达。
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 四碳二羧酸转运载体的研究进展
1.1.1 细菌四碳二羧酸转运载体的分类
1.1.2 DctA型转运载体
1.1.3 DcuA、DcuB和DcuC型转运载体
1.1.4 TRAP载体
1.1.5 CitT载体
1.2 四碳二羧酸转运系统在生物固氮过程中的重要作用
1.2.1 共生固氮菌中四碳二羧酸转运系统研究进展
1.2.2 联合固氮菌中Dct系统研究进展
1.2.3 通过对四碳二羧酸转运系统的改造提高固氮菌的固氮水平
1.3 本工作的立题依据与研究内容
第二章 四碳二羧酸转运调控基因dctBD功能研究
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 常用缓冲溶液
2.1.4 常用溶液
2.1.5 蛋白电泳溶液
2.1.6 试剂
2.2 实验方法
2.2.1 碱裂解法提取质粒DNA
2.2.2 DNA片段的回收与纯化
2.2.3 载体和目标片段的连接
2.2.4 感受态细胞的制备
2.2.5 连接产物转化感受态细胞
2.2.6 质粒的接合转移
2.2.7 重组质粒的PCR检测
2.2.8 菌株生长曲线的测定
2.2.9 菌株固氮活性测定
2.2.10 蛋白含量的测定
2.2.11 原核表达载体的构建及诱导表达
2.2.12 蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3 结果与讨论
2.3.1 DctB和DctD的结构域分析
2.3.2 dctB和dctD基因表达载体的构建
2.3.3 构建携带固氮斯氏假单胞菌A1501 dctBD基因的质粒pLL2922
2.3.4 dctB突变对A1501利用四碳二羧酸能力的影响
2.3.5 dctB基因对菌株固氮活性的影响
第三章 四碳二羧酸转运结构基因dctPQM的功能研究
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株和质粒
3.1.2 插入突变株的构建方法
3.1.3 极性与非极性突变株的构建
3.1.4 DNA的提取
3.1.5 PCR扩增反应
3.1.6 dctM的克隆
3.1.7 极性突变体DNA片段与非极性突变体DNA片段的克隆
3.1.8 pK18mobF与pK18mobG的构建
3.1.9 CaCl_2法制备感受态细胞
3.1.10 连接产物转化感受态细胞
3.1.11 突变株对四碳二羧酸利用的测定
3.2 结果与分析
3.2.1 dctM插入突变株的构建
3.2.2 dctM突变株A1710的生长特性的测定
3.2.3 dctP突变株的构建
3.2.4 dctP突变株对四碳二羧酸的利用情况
3.2.5 dctP和dctM突变株固氮酶活性的测定
3.3 讨论
第四章 dct基因的表达调控的研究
4.1 材料和方法
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 细菌培养
4.1.3 试剂
4.1.4 引物
4.1.5 β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)活性的测定
4.1.6 总RNA抽提
4.1.7 cDNA第一链合成
4.1.8 目的基因扩增
4.2 结果与分析
4.2.1 dctM突变株的互补实验
4.2.2 固氮斯氏假单胞菌dctP-lacZ融合基因的构建
4.2.3 固氮斯氏假单胞菌dctB-lacZ融合基因的构建
4.3 讨论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-09-05
参考文献
- [1].斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501的基因组学研究[D]. 燕永亮.中国农业大学2005
- [2].斯氏假单胞菌固氮调节基因nifLA的表达调控机制研究[D]. 解志红.中国农业大学2005
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