重组人红细胞生成素缓释微球制剂的体内外评价

论文摘要

重组人红细胞生成素（Recombinant human erythropoietin, rhEPO）是一种利用基因工程技术研制的糖蛋白类激素,可以刺激红细胞增殖、分化和成熟,临床上主要用于治疗肾衰竭引起的贫血、艾滋病引起的贫血和癌症化疗引起的贫血。然而rhEPO对贫血的治疗周期较长,体内半衰期很短（4～8h左右）,需要长期频繁注射给药,以维持其药效,给病人的工作和生活带来很大的不便,因此,寻找合适的剂型解决这个问题显得十分迫切。为延长rhEPO单次给药的药效,减少给药次数,增强患者的用药顺应性。本研究应用S/O/W乳化溶剂挥发法,选用生物可降解、生物相容性好的合成聚合物材料聚乳酸羟基乙酸[Poly（D,L-lactic-co-glycolic acid）, PLGA],制备了rhEPO载药PLGA缓释微球制剂。本文对rhEPO缓释微球的基本性质进行了考察,并深入研究微球中rhEPO的体内药效学,药代动力学,同时对微球的毒理学进行了研究。本文首先用牛血清白蛋白（BSA）作为模式蛋白,应用S/O/W乳化溶剂挥发法制备牛血清白蛋白PLGA缓释微球,考察了外水相NaCl浓度对该微球性质的影响。用光学显微镜、激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察了微滴和微球的形态结构,以Bradford法测定微球的蛋白含量并进而研究微球中蛋白质的体外释放特性。结果发现制备微球过程中外水相中的NaCl会抑制微乳内外相的物质交换,进而影响了微球的结构和渗透性,使微球的包封率从60%提高到85%以上,突释率从70%降低到20%以下,粒径从103μm减小到62μm；并可抑制微乳内蛋白质微粒的再水化,保护包封过程中BSA的稳定性。在体外,BSA从微球中缓慢释放时间长达30天。进一步应用S/O/W乳化溶剂挥发法制备了rhEPO载药PLGA缓释微球,应用大量人血清白蛋白（HSA）作为rhEPO的保护剂。本实验应用双夹心ELISA法考察了rhEPO微球的包封率、载药量和突释率,用激光粒度分布仪测定微球的粒径,并应用SEC-HPLC、SDS-PAGE和Western blot考察微球中rhEPO的稳定性,同时测定rhEPO的体内生物学活性。结果rhEPO微球的包封率达到76.2%,载药量为0.21%,突释率仅有14%,所制备的微球粒径为62.9μm。微球中的HSA很好地保护了rhEPO的稳定性,使得微球中的rhEPO没有聚集和降解,而且rhEPO的活性保持完好,体内的生物学活性没有降低。将rhEPO载药PLGA缓释微球通过肌肉单针汁射到SD大鼠体内,在特定的时间通过鼠目内眦采血,测定血常规值的变化考察rhEPO微球的药效学；应用双夹心ELISA法测定血清药物浓度,并应用3p87药代动力学软件拟合药代动力学参数,考察rhEPO微球制剂的半衰期。结果注射rhEPO微球后大鼠血常规值维持高于基准值时间长达25天；血药浓度长时间维持在一个平稳的状态,其高于对照值的时间长达30天,rhEPO微球制剂的半衰期t1/2为14天,与rhEPO水针剂的半衰期t1/2为7小时相比有明显的延长,说明rhEPO微球具有良好的缓释效果,且药物疗效维持的时间较长。聚合物PLGA微球的毒理学考察是给大鼠注射大量的HSA微球观察微球对机体的急性毒性反应,结果没有发现大鼠出现抽搐、呼吸急促、食量变化等异常的急性毒性反应。说明生物可降解聚合物PLGA的生物相容性很好。本文还考察了微球在体内降解后的表面形态变化,结果发现本实验制备的微球30天时基本降解完毕。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 综述
• 1.1 重组人红细胞生成素的一般特性
• 1.1.1 重组人红细胞生成素的性质
• 1.1.2 蛋白类药物的特性
• 1.2 蛋白质传递的挑战性
• 1.3. 蛋白质传递的方法
• 1.3.1 生物可降解微球作为蛋白质传递系统
• 1.3.2 微球的制备方法
• 1.3.3 微球中药物的释放
• 1.4 蛋白质的稳定性
• 1.5 蛋白质微球的其他问题
• 1.5.1 微球与免疫系统的相互作用
• 1.5.2 蛋白质微球的监管问题
• 1.6 结论和展望
• 第二章 外水相中NaCl对S/O/W法制备的牛血清白蛋白PLGA缓释微球性质的影响
• 2.1 实验仪器和材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 牛血清白蛋白微粒的制备
• 2.2.2 牛血清白蛋白微球的制备
• 2.2.3 外水相中NaCl浓度对内外相物质交换的影响
• 2.2.4 外水相NaCl浓度对微球性质的影响
• 2.2.5 微球制备过程中外水相NaCl浓度对蛋白质稳定性的影响
• 2.2.6 微球制备过程中外水相NaCl浓度对微球释放过程的影响
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 蛋白质微粒的表观及粒度
• 2.3.2 外水相中NaCl浓度对内外相物质交换的影响
• 2.3.3 外水相NaCl浓度对微球性质的影响
• 2.3.4 微球制备过程中外水相NaCl浓度对蛋白质稳定性的影响
• 2.3.5 微球制备过程中外水相NaCl浓度对微球释放过程的影响
• 2.4 小结
• 第三章 rhEPO微球的制备、性质及体内外研究
• 3.1 实验仪器和材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 rhEPO缓释微球的制备工艺
• 3.2.2 rhEPO微球的特征
• 3.2.3 rhEPO的体内药效学和药代动力学
• 3.2.4 rhEPO微球体内外释放的相关性
• 3.2.5 微球的毒理学
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 rhEPO微球的特征
• 3.3.2 rhEPO的体内药效学
• 3.3.3 rhEPO微球在大鼠体内的药代动力学
• 3.3.4 rhEPO微球体内外释放的相关性
• 3.3.5 微球的毒理学
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单