平菇黄腐病致病机理的研究

论文摘要

平菇是重要的食用菌栽培品种之一,其子实体营养丰富,味道鲜美,深受消费者的欢迎。但是近年来,平菇栽培中出现的病害特别是黄腐病越来越严重,尤其是秋冬季节栽培的深黑色品种。病情严重时会导致全部栽培料停止出菇,造成严重减产或绝产。我们对平菇黄腐病致病机理进行了研究,为有效的防治平菇黄腐病提供理论依据和基础。首先,我们从感染黄腐病的平菇幼菇子实体中分离、纯化得到2种具平板生长优势的革兰氏阴性杆状细菌（编号为G1和G2）,通过对平菇子实体回接感染实验,发现细菌G1感染的平菇子实体病灶与自然感染的黄腐病状况一致,因此认为细菌G1是导致平菇黄腐病的主要病原菌。经采用传统的生理生化实验与16srDNA序列分析以及Biolog微生物自动鉴定系统分析鉴定,初步确定细菌G1为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。通过了解致病机理,我们还从荧光假单胞菌对平菇菌丝生长速度的影响、对平菇菌丝细胞壁和细胞膜的破坏、利用菌丝内多糖的情况等多个方面来研究荧光假单胞菌对平菇黄腐病的致病机理。结果表明荧光假单胞菌通过利用平菇菌丝细胞壁的主要成分几丁质和纤维素来破坏平菇菌丝的细胞壁,进而破坏其细胞膜,平菇菌丝内含物溢出。内含物中多糖的成分占70%以上,利用苯酚-硫酸法测得50uL牛肉膏液体培养基中培养12h的荧光假单胞菌能在两天内利用平菇菌丝多糖2500ug,可明显看出,荧光假单胞菌严重阻碍了平菇菌丝中糖的代谢,阻碍了子实体的营养积累而抑制了其生长发育。再从发生黄腐病的大棚中分别取水、土壤、培养料、空气等来研究病菌的来源。将收集到的材料进行菌株分离纯化,得到各种细菌的纯菌落,通过采用传统的生理生化实验、染色观察与Biolog微生物自动鉴定系统分析鉴定,发现荧光假单胞菌主要来源于土壤和培养料。本课题还通过平板抑菌实验了解到荧光假单胞菌的敏感药物,并对其敏感药物的抑菌浓度作了进一步的研究。而且还筛选出了一些产链霉素的链霉菌对荧光假单胞菌有抑制作用。最后对平菇黄腐病的防治措施作了总结,平菇黄腐病发生的原因主要是病原菌在通风不够以及管理不规范的不良环境中迅速繁殖等,只要确定了病原菌,并了解其致病机理,就能预防和治疗平菇生产中发生的黄腐病。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.平菇的营养成分、药理作用及生理生活作用
• 1.1 平菇的营养成分
• 1.2 平菇的药理作用
• 1.3 平菇的生理生活特征
• 1.3.1 平菇的形态特征
• 1.3.1.1 菌丝体特征
• 1.3.1.2 子实体特征
• 1.3.2 平菇的生活条件
• 1.3.3 平菇菌丝细胞壁成分
• 1.3.3.1 平菇菌丝细胞壁成分
• 1.3.3.2 平菇菌丝细胞壁成分的性质
• 1.3.3.2.1 几丁质的性质
• 1.3.3.2.2 纤维素的性质
• 2 平菇病虫害概述
• 2.1 平菇细菌性病害国内外研究现状
• 2.2 平菇黄腐病国内外研究现状
• 3 平菇细菌性病害致病机理
• 3.1 真菌细胞壁受到破坏
• 3.2 蛋白质合成受到影响
• 3.3 氧气的摄取受到阻碍
• 3.4 最适pH的改变
• 3.5 酶活性的改变
• 3.6 糖代谢受阻
• 3.7 抗生作用
• 3.8 嗜铁素
• 3.9 细菌的竞争与定植
• 3.10 HCN与酶的作用
• 4 论文立题意义及研究的主要内容
• 第二章 平菇黄腐病病原菌的分离、纯化及鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基及试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 平菇黄腐病病原菌的分离、纯化
• 1.2.1.1 病原菌的分离、纯化
• 1.2.1.2 病原菌对平菇子实体感染
• 1.2.1.2.1 病原菌菌悬液的制备
• 1.2.1.2.2 感染方法
• 1.2.2 平菇黄腐病病原菌的鉴定
• 1.2.2.1 传统分类
• 1.2.2.1.1 病原菌菌体形态观察
• 1.2.2.1.2 生理生化试验
• 1.2.2.1.3 病原菌生长曲线的测定
• 1.2.2.2 菌种自动鉴定系统鉴定
• 1.2.2.3 分子鉴定
• 1.2.2.3.1 材料
• 1.2.2.3.2 操作方法步骤
• 2 结果与分析
• 2.1 平菇黄腐病病原菌的分离结果
• 2.2 病原菌对子实体的感染结果
• 2.3 平菇黄腐病病原菌的鉴定
• 2.3.1 传统分类结果
• 2.3.1.1 病原菌菌落特点和形态
• 2.3.1.2 生理生化特征结果
• 2.3.1.3 病原菌生长曲线
• 2.3.2 Biolog自动鉴定系统鉴定结果
• 2.3.3 分子鉴定结果
• 2.3.3.1 16Sr DNA PCR产物电泳图
• 2.3.3.2 转化后重组子筛选
• 2.3.3.3 构建进化树
• 3 小结
• 第三章 荧光假单胞杆菌对平菇菌丝的影响和病理研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 荧光假单胞菌对平菇菌丝生长速度的影响的测定
• 1.2.1.1 对用PDA固体培养基培养的菌丝的影响
• 1.2.1.2 对用PDA液体培养基培养的菌丝的影响
• 1.2.1.3 DNS法册发酵液中病原菌破裂平菇菌丝的实验
• 1.2.2 荧光假单胞菌对平菇菌丝细胞壁的影响
• 1.2.2.1 产几丁质酶和纤维素酶的鉴别实验
• 1.2.2.2 还原糖法测定病原菌产生纤维素酶的酶活
• 1.2.2.3 还原糖法测定病原菌产生几丁质酶的酶活
• 1.2.3 荧光假单胞杆菌对平菇菌丝细胞膜的影响
• 1.2.4 苯酚硫酸法测定细菌利用平菇菌丝内可溶性糖的情况
• 1.2.4.1 实验原理
• 1.2.4.2 实验步骤
• 2 结果与分析
• 2.1 对菌丝体的影响
• 2.1.1 对用PDA固体培养基培养的菌丝的影响
• 2.1.2 对用PDA液体培养基培养的菌丝的影响
• 2.1.2.1 平菇菌丝发酵液颜色及菌丝干重变化
• 2.1.2.2 DNS法测定病原菌破裂平菇菌丝的实验
• 2.1.2.3 菌丝形态变化
• 2.1.3 结果分析
• 2.2 病原菌对平菇菌丝细胞膜的影响
• 2.2.1 全波段扫描
• 2.2.2 结果分析
• 2.3 病原菌对平菇菌丝细胞壁的影响
• 2.3.1 酶活标准曲线
• 2.3.2 几丁质酶的鉴定
• 2.3.3 纤维素酶的鉴定
• 2.3.4 结果分析
• 2.4 病原菌分解平菇菌丝内可溶性糖的实验
• 2.4.1 标准曲线的制作
• 2.4.2 培养液中可溶性糖的变化
• 2.4.3 结果分析
• 3 小结
• 第四章 平菇黄腐病病原菌的来源
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种与试剂、仪器
• 1.1.1 菌种采集
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.1.3 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同来源微生物的采集
• 1.2.1.1 空气中微生物的采集
• 1.2.1.2 土壤中微生物的采集
• 1.2.1.3 培养微生物的采集
• 1.2.2 镜检
• 1.2.2.1 革兰氏染色
• 1.2.2.2 镜检并拍照
• 1.2.3 生理生化实验进一步筛选相似菌株
• 1.2.4 Biolog微生物自动鉴定系统进行鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌落平板照片
• 2.2 平板计数
• 2.2.1 统计微生物总数
• 2.2.2 按菌落形态统计
• 2.2.2.1 空气中
• 2.2.2.2 土壤中
• 2.2.2.3 培养料中
• 2.3 镜检及拍照
• 2.4 生理生化实验
• 2.5 Biolog微生物自动鉴定系统鉴定结果
• 3 小结
• 第五章 平菇黄腐病防治方法的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 药敏片抑菌实验
• 1.2.2 敏感药物抑菌浓度
• 1.2.3 医用细菌杀菌剂抑菌实验
• 1.2.4 链霉菌发酵液及菌体提取物抑菌实验
• 1.2.4.1 链霉菌平板培养物抑菌
• 1.2.4.2 链霉菌液体培养物抑菌
• 2 结果与分析
• 2.1 药敏片对病原菌的抑制作用
• 2.2 各浓度的敏感药物抑菌作用
• 2.3 医用细菌杀菌剂抑菌结果
• 2.4 链霉菌液体发酵液及菌体提取物抑菌结果
• 3 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表