甜瓜遗传图谱的构建与抗病基因遗传分析

论文摘要

新疆作为厚皮甜瓜的次生起源中心之一,有许多品质优良的甜瓜种质资源,然而新疆甜瓜地方种对白粉病、霜霉病等病害抗病性均较差,这些病害严重阻碍新疆哈密瓜产业的发展。甜瓜抗病等重要功能基因的定位与克隆是甜瓜基因组学研究的重要内容,也是分子育种的关键。本研究以新疆特色经济作物甜瓜为实验材料,开展甜瓜分子遗传学研究,并对甜瓜抗病性等重要农艺性状遗传分析与基因定位。主要完成以下4方面的研究内容:（1）建立甜瓜分子遗传图谱,对甜瓜果实、种子等重要农艺性状进行基因定位研究,发现控制这些性状的基因位点及其相互关系。（2）利用简并引物PCR的方法克隆甜瓜抗病基因同源序列（RGA）,对甜瓜RGA进行生物信息学分析、遗传分析以及与黄瓜的比较基因组学分析,研究其基因组分布特征、演化关系以及与抗病基因之间的关系。（3）利用两个抗病遗传分离群体对甜瓜抗白粉病基因Pm-AN进行基因定位与比较基因组学研究,为抗病基因的克隆与分子育种奠定基础。（4）通过分子标记辅助选择,获得多个优质抗病甜瓜株系。主要研究内容与结果如下:以遗传性状差异较大的甜瓜材料日本安农二号与新疆哈密瓜K413杂交产生的143个F2单株为作图群体,以扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）与简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）分子标记为主构建了包含12个连锁群,142个遗传标记位点的甜瓜遗传图谱,其中包括121个AFLP标记,16个SSR标记,3个STS标记,2个性状标记,连锁群总长度为1014.2cM。应用复合区间作图法对甜瓜果实的长、宽、性状、果肉颜色、糖度、硬度以及甜瓜种子的长、宽、形状、重量性状进行遗传定位与分析。基因定位结果显示控制果肉颜色基因位于C9连锁群AFLP分子标记NDAA与NCFA之间。其它性状表现为数量性状控制,共检测到25个数量性状基因座,不同性状基因座位有重叠分布的特点。其中C5连锁群标记NCA-N73C区间检测到数量性状位点（quantitative trait loci, QTLs） Sl5.1,Sw5.1,Swt5.1分别控制种子长,宽与千粒重,分别可解释表型变异的17%,19%和23%。该区域包含的来自母本安农二号的基因位点的对甜瓜种子的长、宽、千粒重均有明显的抑制作用;位于C8连锁群标记N73A与NFDA间的QTL通过影响种子的宽度从而影响种子的形状与重量;同样位于C8连锁群的果实形状QTL Fs8.1在F2和F3代中均检测到,分别解释表型变异的25%和19%,表现为部分显性,来自安农二号的等位基因抑制甜瓜果实伸长,生成圆形甜瓜;研究中还发现控制甜瓜果实心糖、边糖、果实硬度的QTL各一个。为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因（RGA）,根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中641与324两个RGA为本研究首次发现。将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR（coiled-coil nucleotide binding site leucine-rich repeat）与TIR-NBS-LRR（Toll and interleukin-1 receptor nucleotide binding site leucine-rich repeat）两类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因。通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Prv存在于nbs47-3（MRGH11）与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv。白粉病是甜瓜重要的病害之一,在世界范围上均有分布。本研究对甜瓜抗白粉病基因进行了分析与基因定位研究,建立安农二号×哈密瓜K413和安农二号×皇后两个群体,通过集群分离分析（Bulked Segregant Analysis, BSA）筛选连锁标记、比较基因组学作图、RGA标记作图,发现安农二号对白粉病的抗性受单一显性基因控制,将其命名为Pm-AN,对其进行遗传作图表明,Pm-AN位于甜瓜第V连锁群两个共显性分子标记RPW与MRGH63B之间,Pm-AN与两个分子标记之间的遗传距离分别为1.4-1.8cM和1.6-2cM。分子标记SRAP23、E1与抗白粉病基因Pm-AN共分离。Pm-AN区域存在多个RGA序列,Pm-AN与其中MRGH5和Vat共分离,比较基因组学分析表明该区域在甜瓜与黄瓜间存在明显的共线性。在所用两个群体中该区域均存在明显的偏分离现象。抗白粉病基因Pm-AN位于偏分离区域的中心位置。在对甜瓜抗白粉病基因进行定位,获得连锁分子标记的基础上,利用标记辅助选择与传统育种相结合的方法,结合抗枯萎病鉴定结果,从抗病甜瓜品种安农二号与新疆优质甜瓜杂交F2及F3后代中,筛选获得纯合双抗优质甜瓜株系2个,外观好且糖度均在18以上,获得其他类型优质抗病株系多个。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 研究目的与意义
• 2 国内外研究现状与分析
• 2.1 分子标记概述
• 2.2 甜瓜分子遗传图谱的构建
• 2.3 甜瓜基因定位研究
• 2.4 甜瓜抗病基因同源序列（RGA）研究
• 2.5 甜瓜抗病基因的克隆
• 第二章 甜瓜遗传图谱的构建与重要农艺性状的遗传定位
• 1 材料
• 2 实验方法
• 2.1 建立甜瓜遗传分离群体
• 2.2 甜瓜基因组DNA 的提取
• 2.3 甜瓜亲本间多态DNA 分子标记的筛选
• 2.4 多态性分子标记的检测与分析
• 2.5 农艺性状鉴定
• 2.6 建立甜瓜分子遗传图谱
• 2.7 甜瓜质量性状与数量性状进行遗传定位
• 3 结果与分析
• 3.1 甜瓜遗传分离群体的建立
• 3.2 甜瓜遗传图谱的建立
• 3.3 甜瓜重要农艺性状的基因定位
• 4 讨论
• 第三章 甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析
• 1 材料
• 2 试验方法
• 2.1 PCR 引物的设计
• 2.2 甜瓜基因组DNA 提取与PCR 扩增
• 2.3 特异扩增条带的回收与克隆
• 2.4 重组子分类与测序
• 2.5 序列分析与RGA 进化树绘制
• 2.6 利用黄瓜基因组序列图进行比较基因组学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 克隆抗病基因的序列分析与引物设计
• 3.2 重组子筛选、分类与测序
• 3.3 甜瓜抗病基因同源序列的分析
• 4 讨论
• 第四章 甜瓜抗白粉病基因遗传定位与分子育种
• 1 材料
• 2 试验方法
• 2.1 抗病遗传分离群体的建立与抗病鉴定
• 2.2 BSA 法筛选抗白粉病基因连锁的分子标记
• 2.3 甜瓜抗白粉病基因初步定位
• 2.4 安农二号×皇后F2 群体抗白粉病遗传分析
• 2.5 用扩大感、抗病池进一步定位抗白粉病基因
• 2.6 抗白粉病分子标记的克隆与比较基因组学分析
• 2.7 候选RGA 遗传分析
• 2.8 抗白粉病基因位点的SSR 标记分析
• 2.9 抗白粉病基因区域偏分离分析
• 2.10 分子标记辅助选择优质抗病甜瓜品系
• 3 结果与分析
• 3.1 抗病遗传分离群体的建立与抗病鉴定
• 3.2 抗白粉病基因AFLP 分子标记
• 3.3 AFLP 标记在安农二号×皇后群体中验证
• 3.4 扩大感、抗病池群体进一步定位抗白粉病基因
• 3.5 抗白粉病分子标记的克隆与比较基因组学分析
• 3.6 RGA 标记和SSR 标记
• 3.7 分子标记偏分离分析
• 3.8 分子标记辅助选择优质抗病甜瓜品系
• 4. 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附表1 构建遗传图谱的分子标记数据与其他农艺性状数据
• 附表2 从安农二号中克隆的不同抗病基因同源序列测序结果
• 附表3 安农二号×皇后的F2群体标记检测及白粉病鉴定数据
• 附表4 分子标记MC/EA, MA/AF 的测序结果
• 在读期间公开发表论文与申请专利
• 致谢