小麦矮腥黑穗病菌风险分析、培养、检测及无害化处理技术的研究

论文摘要

小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑穗病菌（Tilletia contraversa Kiihn,TCK）引起的对麦类生产具有极强破坏性的危险性病害,TCK抗逆性强、极难防治,是重要的国际性检疫对象。由于TCK在国际粮食贸易中的重要性,因此国内外许多学者对TCK的检疫鉴定方法和检疫处理方面做了大量的研究。TCK与其近似种小麦网腥黑穗病菌（Tilletia caries Tul, TCT）、小麦光腥黑穗病菌（Tilletia foetida, TFL）的冬孢子在形态学上极为相似,难以区分,传统的方法停留在病害症状、冬孢子形态、自发荧光显微学特征、萌发生理学、生化特征等方面对TCK进行鉴定,但这些方法费时费力,且在贸易中极易发生纠纷,因此建立快速准确的TCK分子鉴定方法势在必行。辐照处理、药剂熏蒸、热力灭菌是现在处理TCK冬孢子常用的方法,其中辐照处理受电子束穿透能力的影响,未能广泛应用,药剂处理会对环境造成一定的影响。有研究报道TCK冬孢子在100℃干热灭菌条件下处理10min后,其萌发率不受影响,且用上述3种方法处理携带大量TCK的麦类有一定的困难,因此寻找一种处理携带TCK疫麦的经济、方便、环保的方法对防止TCK的大量传播具有及其重要的意义。由于TCK对麦类具有毁灭性的破坏,且我国具有适宜其生长的环境条件和易感寄主,一旦此病菌传入我国将会带来巨大的经济损失。以前我国检疫人员多次在进口小麦中截获TCK,但TCK的寄主非常广泛,极有可能随其它寄主传入我国。文中以TCK的寄主为主要分析对象,按照FAO有害生物风险分析准则对携带小麦矮腥黑穗病菌的寄主进行了风险评估。经过评估,初步确定携带小麦矮腥黑穗病菌的输华小麦风险为很高,携带小麦矮腥黑穗病菌的输华大麦风险为高,携带小麦矮腥黑穗病菌的输华黑麦和杂草种子风险为中。本文对小麦矮腥黑穗病菌冬孢子萌发条件和菌丝培养进行了初步研究,探索不同前处理方式,不同培养基对不同时间采集的小麦矮腥黑穗病菌冬孢子萌发的影响,实验结果表明：无需消毒处理,在土壤浸出液培养基上的（来自新疆的）采集保存时间较短的小麦矮腥黑穗病菌冬孢子的萌发率最大。将萌发的小麦矮腥黑穗病菌冬孢子转移至马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、T-19培养基中,在不同温度下培养,结果表明：小麦矮腥黑穗病菌菌丝在T-19固体培养基上生长最好,且有双核和单核菌丝之分,在16℃为双核菌丝,在20℃大部分为单核菌丝,将双核菌丝转入20℃培养时可变为单核菌丝,但将单核菌丝转入16℃培养时却仍为单核菌丝,其中双核菌丝可完成整个世代的培养,但在传代培养之后逐渐变为单核菌丝,失去产生冬孢子的能力。根据文章上公布的TCK的普通PCR引物及特异性引物和探针,合成了TCK的普通PCR引物及Taqman探针和引物,结果只有TCK出现特异性条带和扩增曲线,实现了利用普通PCR及实时荧光PCR技术了对TCK冬孢子和菌丝的快速鉴定。本实验初步研究了堆肥对小麦矮腥黑穗病菌冬孢子的灭活与降解作用,结果表明：TCK冬孢子的萌发率随着堆肥的进程而逐渐下降,在发酵第10d检测时,TCK冬孢子完全失去萌发活性,此方法为进境携带大量TCK的麦类和TCK高发区的麦类的处理提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 小麦矮腥黑穗病菌概述
• 1.1.1 分类及命名
• 1.1.2 存活期
• 1.1.3 传播方式
• 1.1.4 侵染条件
• 1.1.5 寄主植物与症状
• 1.1.6 区域分布与经济重要性
• 1.2 小麦矮腥黑穗病菌风险分析研究概述
• 1.3 小麦矮腥黑穗病菌生物学特性
• 1.3.1 形态学
• 1.3.2 近似种
• 1.3.3 萌发生理学
• 1.3.4 体外培养
• 1.3.5 细胞学
• 1.4 小麦矮腥黑穗病菌鉴定方法
• 1.4.1 常规真菌形态学鉴定研究
• 1.4.2 生物化学鉴定研究
• 1.4.3 免疫学鉴定研究
• 1.4.4 分子生物学鉴定研究
• 1.5 无害化处理方法
• 1.5.1 物理方法灭活
• 1.5.2 化学试剂灭活
• 1.5.3 生物灭活方法
• 1.6 实验内容与路线
• 1.7 论文创新点
• 第二章 风险分析
• 2.1 风险评估
• 2.1.1 有害生物归类
• 2.1.2 检疫性有害生物传入和扩散可能性评估
• 2.1.3 风险评估总结
• 2.2 风险管理
• 第三章 材料与方法
• 3.1 菌株来源
• 3.2 主要仪器与设备
• 3.3 主要试剂及配置
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 小麦矮腥黑穗病菌冬孢子萌发条件及菌丝培养的研究
• 3.4.2 小麦矮腥黑穗病菌菌丝培养条件的研究
• 3.4.3 小麦矮腥黑穗病菌分子检测的研究
• 3.4.4 小麦矮腥黑穗病菌冬孢子无害化处理的研究
• 第四章 结果与分析
• 4.1 TCK冬孢子萌发结果
• 4.1.1 感病麦穗及菌瘿描述
• 4.1.2 TCK冬孢子萌发结果
• 4.1.3 不同采集时间对TCK冬孢子萌发率的影响
• 4.1.4 不同前处理方式和不同培养基对TCK萌发的影响
• 4.2 TCK菌丝体培养结果
• 4.2.1 TCK在18℃条件下培养结果
• 4.2.2 温度和培养基对TCK菌丝生长的影响
• 4.2.3 液体培养基对TCK生长的影响
• 4.3 基因组DNA提取结果
• 4.3.1 TCK基因组DNA提取结果
• 4.3.2 阴性对照DNA提取结果
• 4.3.3 麦类基因组DNA提取结果
• 4.4 小麦矮腥黑穗病菌分子检测体系建立
• 4.4.1 普通PCR技术对黑麦草中TCK的检测
• 4.4.2 小麦矮腥黑穗病菌TaqMan实时荧光PCR检测
• 4.5 TCK堆肥处理结果
• 4.5.1 堆肥中TCK冬孢子萌发率的变化
• 4.5.2 堆肥中温度的变化
• 4.5.3 堆肥中pH的变化
• 4.5.4 堆肥中水分的变化
• 4.5.5 堆肥中C/N比的变化
• 第五章 讨论
• 5.1 关于TCK冬孢子萌发的研究
• 5.1.1 影响TCK冬孢子萌发的主要因素
• 5.1.2 培养基上完成TCK生活史的现象
• 5.2 关于TCK菌丝体培养的研究
• 5.3 关于TCK分子检测研究
• 5.3.1 普通PCR
• 5.3.2 实时荧光PCR
• 5.4 关于TCK冬孢子堆肥处理的研究
• 5.4.1 堆肥温度对TCK冬孢子活性的影响
• 5.4.2 堆体理化性质的变化
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录