Bt杀虫基因Cry3A在桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌和常驻菌中的转化和表达研究

论文摘要

天牛是鞘翅目昆虫中较大的一个类群,在世界各地广有分布,其幼虫大多以木质纤维为食,林木、果树、桑、茶、棉、木建材料、家具等都可以受到天牛的危害,林木的天牛受害率达20-90%,每年造成的经济损失上亿元。由于天牛幼虫营钻蛀性生活,生活隐蔽,活动期长,所以防治工作难度很大。目前的主要防治方法仍是以传统的人工钩杀幼虫、砸卵、堵洞和化学药剂防治等方法为主。其中人工防治费时、费工、成本又高,不适用于规模化大农场生产;利用化学防治药剂防治由于药剂有效期短,不易达到虫体,而且容易导致害虫抗药性增强以及具有污染环境、杀伤天敌的弊端。因此,探索新的防治途径,开发新的防治技术,已成为生产上的迫切要求。新的害虫防治方法和理论完善与发展离不开昆虫生理生化的研究。近年来,研究昆虫肠道正常菌群和肠道微生态以探索新的害虫控制方法正在成为国内外研究的热点之一。本文用传统培养方法和现代分子生物学方法-16S rDNA分析法对桑粒肩天牛幼虫肠道微生物组成进行了研究,在此基础上,首次探索将杀虫基因转入天牛幼虫肠道常驻的和优势的正常菌群载体菌,以构建在昆虫肠道中高定植率、高生存力、高繁殖并能表达杀虫毒蛋白伴孢晶体的新型杀虫工程菌。研究将可能为害虫的生物防治开辟一条新的途径,为新型转基因生物农药的研发提供理论依据与技术支撑。主要研究结果如下:①用传统的培养方法从桑粒肩天牛幼虫肠道中共分离鉴定出18个种的细菌,它们分别是产酸克雷伯氏菌（Klebsilla Oxytoca）、成团杆菌（Enterobacter cloacae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、弗氏志贺氏菌（Shiqella flexneri）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、鲍氏志贺氏菌（Shiqella boydii）、人葡萄球菌（Staphylococcus homis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、Breneria quercina、无花果沙雷氏菌（Serratia ficaria）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、Naxibacter haematophilus、产气长杆菌（Enterobacter aerogens）、克里斯汀微球菌（ Micrococcus kristinae）、阿氏肠杆菌（Enterobacter absburiae）。其中溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、人葡萄球菌（S. homis）、短短芽孢杆菌（B. brevis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）等在幼虫肠道中全年均能分离到,成团杆菌（E. cloacae）、产气肠杆菌（E. aerogens）、阿氏肠杆菌（E. absburiae）可在1～2月份外的全年的大部分时间分离到,其它细菌种类则只能在4～11月份分离到,说明至少溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、人葡萄球菌（S. homis）、短短芽孢杆菌（B. brevis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）应为天牛肠道常驻菌群,而其余种类微生物则很可能是随进食或与环境接触而进入的过路菌群。根据分离率和肠道菌群培养的数量统计结果表明天牛肠道优势菌群是葡萄球菌属（Staphylococcus）细菌中的溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）和人葡萄球菌（S. homis）,其菌量分别为7.74±0.61和7.66±0.25,分离率分别为100%和98.09%。②将按传统方法从桑粒肩天牛幼虫肠道分离、鉴定的18个不同种的细菌作为PCR模板,进行16S rDNA序列的分析,经与数据库中登录序列比对,鉴定结果与分离培养方法所获得的结果一致。所测序列与Genbank中同种细菌的16S rDNA序列相似性分别为98.58%、99.18%、97.86%、99.89%、98.02%、99.19%、99.32%、98.46%、99.30%、98.05%、96.97%、98.33%、99.46%、99.60%、99.03%、99.45%、99.01%、99.52%,均高于98%,说明鉴定结果正确。所得菌株的16S rRNA都已在Genbank中登录注册,系统接受号为EU554427-EU554444。③将含有红霉素抗性基因和cry3A基因的Escherichia coli -Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305a和pHT7911转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势常驻菌溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、人葡萄球菌（S. homis）和常驻内生菌短短芽孢杆菌（B. brevis）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）中,获得的转化子中外源基因能稳定自主复制,而且其中用红霉素抗性平板筛选出的常驻内生工程菌转化子在产伴孢晶体发酵培养基中培养至90%以上芽孢脱落晶体释放时的菌液可提取到经SDS-PAGE分析分子量为65KDa的伴孢晶体蛋白,说明已成功获得了四株转基因杀虫工程菌。对工程菌在天牛幼虫肠道内的定殖能力和生物毒力进一步测定的结果显示此四株工程菌既能在桑粒肩天牛幼虫肠道内定殖,又对天牛幼虫具有一定的杀虫活性。

论文目录

摘要

ABSTRACT

1 绪论

1.1 立题依据

1.2 国内外研究进展

1.2.1 肠道微生物传统分离、纯化、鉴定方法的发展

1.2.2 现代分子生物学方法对肠道微生物种类分类鉴定的研究

1.2.3 昆虫及其它动植物内生微生物的微生态学研究进展

1.2.4 苏云金杆菌及其转基因杀虫剂的研究、利用进展

1.3 研究目的

1.4 研究内容和技术路线

1.4.1 研究内容

1.4.2 技术路线

1.5 本研究的创新点

2 材料与方法

2.1 供试昆虫、菌株与质粒

2.2 培养基及主要试剂

2.2.1 培养基

2.2.2 微生物传统鉴定试剂

2.2.3 克隆和转化所用试剂

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳所用试剂

2.2.5 转化菌株筛选和伴孢晶体蛋白观察、提取所用试剂

2.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所用试剂

2.3 主要仪器

2.4 桑粒肩天牛幼虫肠道微生物的分离、纯化、鉴定

2.4.1 肠道微生物样品制备

2.4.2 肠道微生物的分离、纯化

2.4.3 肠道微生物的生理生化鉴定

2.4.4 肠道微生物的分子生物学鉴定

2.5 转化宿主菌株的筛选

2.5.1 野生菌株内生质粒的消除

2.5.2 红霉素抗性缺陷型菌株的筛选

2.5.3 Cry3A 缺陷型菌株的筛选

2.6 桑粒肩天牛肠道内生优势菌和常驻菌转化系统的建立

2.6.1 转化宿主菌株对数生长早期的确定和感受态细胞的制备

2.6.2 肠道内生菌的转化系统的建立和优化

2.7 转化子的检测

2.7.1 转化子中Cry3A 基因的检测

2.7.2 转化子中重组质粒抽提及酶切图谱分析

2.8 外源基因在天牛肠道优势菌和常驻菌中的稳定性及对宿主菌生长特性影响的测试

2.8.1 外源基因在转化子中的稳定性测试

2.8.2 外源基因对宿主菌生长特性影响的测试

2.9 表达宿主菌株和培养基的筛选与工程菌发酵培养

2.9.1 宿主菌株胞外蛋白酶活性检测

2.9.2 发酵培养基的筛选

2.9.3 工程菌的发酵培养

2.10 伴胞晶体的提取纯化与检测分析

2.10.1 伴胞晶体蛋白的观察和提取纯化

2.10.2 伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE 胶电泳分析

2.11 工程菌在天牛肠道内的定殖和生物活性初步测试

3 结果与分析

3.1 桑粒肩天牛幼虫肠道可培养菌种类及多样性

3.1.1 桑天牛幼虫肠道可培养菌群的种类和丰度

3.1.2 桑天牛幼虫肠道的常驻菌群和优势菌群

3.2 转化宿主菌株的确定

3.3 桑粒肩天牛肠道优势菌和常驻菌转化系统的建立

3.3.1 转化宿主菌株指数生长期的确定和感受态细胞的制备

3.3.2 肠道内生菌的转化系统的建立

3.3.3 转化子检验

3.4 工程菌中外源基因的稳定性及生长特性

3.5 杀虫毒蛋白最适表达宿主菌株和发酵培养基的确定

3.6 工程菌伴胞晶体蛋白的形态、提取和分析

3.7 工程菌在天牛幼虫肠道内的定殖能力和生物活性

4 讨论

4.1 桑粒肩天牛幼虫肠道的优势菌群和常驻菌群

4.2 16S rDNA 序列分析法是对传统微生物分离、鉴定方法的不可或缺的补充

4.3 肠道内生菌工程菌出发菌株的筛选

4.4 影响受体菌转化效率的因素

4.5 外源CRY3A 基因的表达促进机制

4.6 伴孢晶体蛋白的提取、纯化

4.7 工程菌在天牛肠道内的定殖能力和生物活性

5 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后续研究工作的展望

致谢

参考文献

附录

A.作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录

B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目及得奖情况

Bt杀虫基因Cry3A在桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌和常驻菌中的转化和表达研究

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