益肾缓衰方对肾小管间质纤维化的实验研究

论文摘要

背景:肾小管间质纤维化（renal tubulointerstitial fibrosis TIF）是各种肾脏疾病进展至终末期肾病的共同表现和主要病理基础,是肾功能衰竭的共同途径。它是以肾小管上皮细胞变性、萎缩、消失,间质中淋巴细胞和单核细胞浸润、同时聚集大量的肌成纤维细胞和细胞外基质为主要特征。在二十世纪的漫长岁月里人们对肾脏疾病的研究中,对肾小球疾病的认识相对较深入,而对肾小管间质病理改变的研究相对较少,甚至是忽略掉的。自上世纪九十年代,Risdon等首次发现肾小球滤过率（GFR）的下降与肾小管萎缩呈正相关,而与肾小球损害无明显相关性以来,越来越多的研究表明,肾功能损害与肾小管间质病理改变的程度密切相关。在终末期肾病（ESRD）患者中肾小管间质疾病为原发病的占到20%—30%,而在各种常见的肾小球疾病发展的不同阶段都合并有不同程度的肾小管间质的损伤。有大量临床和试验研究表明,肾小管间质损害程度与肾功能的相关性比肾小球病变更为密切,是反映肾功能下降严重程度及判断预后最重要的指标。我们可以认为在CKD进展过程中,肾小管间质损伤起着比肾小球病变更为重要的作用,并决定着CKD的预后和转归。因此,探讨肾间质纤维化的形成机制及防治措施,在临床上寻找能阻止或减缓肾间质纤维化的药物具有重要意义。益肾缓衰方作为我院院内制剂用于慢性肾衰竭治疗已近二十年,并取得了良好的临床疗效。主要药物组成有生黄芪、人参、当归、川芎、赤芍、茯苓、鸡血藤、熟大黄等,是具益气养血活血、利湿泻浊之功的中药复方。我科已往的研究工作证实该药能减轻5/6肾切除造模大鼠残余肾ECM的积聚,抑制促纤维化因子TGF-β在残余肾表达,改善肾小球硬化和抑制小管-间质纤维化程度。在缓衰方对5/6肾切除大鼠肾内微血管重塑及血管内皮生长因子（VEGF）表达影响的研究中证实,缓衰方与血管紧张素转换酶受体拮抗剂（科素亚）均有促进残余肾内VEGF表达,减轻肾内微血管丢失以及减轻肾纤维化程度的作用。通过益肾缓衰方治疗46例慢性马兜铃酸肾病临床观察研究我们发现,此方可明显延缓慢性马兜铃酸肾病患者肾功能进行性减退的速度。而在通过对肾活检的肾小管间质损伤较明显的78名CKD患者的观察,收集相关实验室检查指标,肾脏病理资料,结合中医临床资料进行分析,我们得出如下结论:（1）CKD患者血瘀证与肾小管间质损伤存在显著相关性,血瘀证可能是CKD患者中医证候因素中影响CKD进展的关键因素。（2）湿热证与血瘀证之间存在密切联系,“湿热央瘀”是CKD患者中医证候的重要内容。（3）在CKD患者湿热证、血瘀证可能是影响CKD进展的重要因素。这一有关肾小管间质纤维化的证型研究,为本次实验选用益气养血活血,利湿泻浊之功的益肾缓衰方提供了坚实依据,为进一步阐明中医药在肾小管间质损伤中的作用提供了重要的理论基础。目的:本研究通过对服用本院制剂益肾缓衰方、厄贝沙坦及动物无菌饮用水的单侧输尿管结扎（UUO）大鼠模型各组的肾脏纤维化程度的研究,以明确本院制剂益肾缓衰方在延缓肾间质纤维化及保护肾功能中的作用。通过利用UUO大鼠小管间质损伤模型,观察药物对大鼠血液生化指标的影响,组织病理损害的程度,采用免疫组化法检测大鼠肾脏组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,骨形态形成蛋白-7（BMP-7）的表达,探索这两者的相关机制和联系性,探讨益肾缓衰方是否能通过调节α-SMA及BMP-7的表达,从而达到减轻肾脏病理变化,改善肾功能的作用。探讨益气活血利湿法在肾小管间质纤维化中的防治作用及中医药在肾小管间质纤维化中的积极作用,为临床上CKD患者的治疗提供可推广的有效药物与相应的诊疗思路。方法:本实验以180-200g健康雄性Wister大鼠（解放军军事医学科学院提供）为研究对象,动物适应性饲养一周后,将32只大鼠随机分为四组,每组8只:假手术组,模型组,中药组,厄贝沙坦组。其中模型组,中药组及厄贝沙坦组造UUO大鼠模型:均用10%水合氯醛（2.0～3.0ml/kg）腹腔注射麻醉,手术野去毛,75%乙醇消毒,选择腹正中线切口稍偏左,依次切开皮肤至腹腔,游离肾脏及输尿管,将左侧输尿管用组织钳托起中段部位,止血钳夹住,在两端用4-0丝线结扎左侧输尿管近肾盂段及远端,然后连续缝合皮肤。假手术组手术入路方式同模型组,但打开腹腔后游离输尿管不结扎,即缝合皮肤。模型组予动物无菌饮用水12ml/kg.d,假手术组予动物无菌饮用水12ml/kg.d,中药组:予中药药液12ml/kg.d（用药量相当于成人每天每公斤体重的15倍）厄贝沙坦组予1mg/ml浓度厄贝沙坦溶液（无菌饮用水每日现配）,12ml/kg.d,各组均连续灌胃10天,日一次。术后第10d处死各组大鼠,从股动脉采血,分离血清,测定血肌酐（Scr）,尿素氮（BUN）。剖取左侧肾脏原位灌洗,用10%甲醛固定,石蜡包埋,以2um厚切片,行常规HE染色,以了解各组病理改变情况,行Masson染色,用显微镜图像分析仪（Olympus ix70倒置荧光显微镜）及Imagepruplus图像分析系统进行分析,阳性面积（μm2）作为统计数据,评定各组肾小管间质损害程度。最终结果采用SPSS统计软件进行相关分析。结果:（1）肾功能测定:与假手术组相比较,其余三组Scr均明显升高（P＜0.05）,经中药及厄贝沙坦治疗后,下降不明显（P＞0.05）。而BUN检测显示,与假手术组比较,其余三组BUN均明显上升（P＜0.05）,但与模型组比较,中药组与厄贝沙坦组均有明显下降（P＜0.05）,两治疗组之间比较,无明显差别。（P＞0.05）。即经过治疗后,对Scr影响不明显,对BUN有较明显的影响,但未降至正常水平。（2）肾脏病理:肉眼观察可见:假手术组大鼠肾脏颜色暗红,大小形态正常。模型组,中药组及厄贝沙坦组大鼠结扎侧肾脏颜色淡,肿大明显,有囊性感,内存黄褐色混浊液体,肾盂明显扩张,实质变薄。光镜下可见:①HE染色,假手术组偶见肾小管上皮细胞空泡变性,灶状单核细胞浸润;模型组可见弥漫的肾小管上皮细胞空泡变性,部分管腔内有蛋白或细胞管型,灶状小管扩张、萎缩,偶见坏死,肾间质有多灶状单核细胞浸润和纤维化,肾小球无明显病理变化。中药组及厄贝沙坦组上述改变均有所减轻。②Masson染色,模型组可见间质大量蓝染胶原纤维增生,肾小球病变不明显。中药组,厄贝沙坦组肾间质胶原纤维阳性染色面积较模型组均明显下降（P＜0.01）,两治疗组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）肾脏中α-SMA、BMP-7的表达及变化:α-SMA在各组中的表达:假手术组的血管壁平滑肌细胞呈强阳性表达,肾小球和肾小管上皮细胞无明显着色,肾髓质稀疏散在分布呈弱阳性。模型组表达部位以肾间质为主,主要围绕在萎缩或扩张的肾小管周围,或纤维化的肾间质中。中药组和厄贝沙坦组可见散在于纤维化的肾间质处有少量表达;BMP-7在各组中的表达:假手术组大鼠肾脏在远曲小管、集合管均有表达,且表达较强烈,在近端小管上皮细胞有少量表达,在肾小球内基本无表达。在髓质区表达明显高于在皮质区的表达。模型组大鼠肾间质纤维化程度加重,BMP-7表达明显减少;中药组和厄贝沙坦组大鼠肾脏BMP-7表达量均较模型组明显增加,较假手术组减少。结论:1.益肾缓衰方可明显降低血清尿素氮含量,效果与厄贝沙坦无明显差别。但无明显降低肌酐作用,厄贝沙坦亦相同。2.益肾缓衰方与厄贝沙坦均可抑制α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,增加骨形态形成蛋白-7（BMP-7）在UUO大鼠肾脏组织中的表达,抑制了肾小管上皮细胞转分化,增加了ECM的降解,且两治疗组间差异无统计学意义,说明益肾缓衰方治疗效果与厄贝沙坦相似,均有减轻肾脏纤维化作用。3.益肾缓衰方组与模型组比较,α—SMA的阳性表达面积、Masson染色的胶原纤维面积均减少,证实益肾缓衰方减少了增生的ECM成分,减轻肾脏纤维化的病变程度。4.在肾小管间质纤维化过程中,肾间质纤维化面积与BUN、Scr均呈正相关（r=0.637,P＜0.001）,提示肾功能损害与间质纤维化程度相关,与α-SMA的表达呈正相关（r=0.845,P＜0.001）,与BMP-7的表达呈负相关（r=-0.865,P＜0.001）,α-SMA与BMP-7的表达呈负相关（r=-0.983,P＜0.001）。提示益肾缓衰方可能通过抑制α-SMA的表达,及增加BMP-7的表达来抑制肾小管上皮转分化,从而减轻肾脏纤维化程度。

论文目录

• 1 中文摘要:
• 2 英文摘要:
• 3 英文缩写中文对照表:
• 4 文献综述:
• 4.1 肾小管间质纤维化:
• 4.1.1 肾小管间质纤维化在慢性肾脏病进展中的意义:
• 4.1.2 现代医学对TIF作用机理及相关因子的研究:
• 4.1.3 肾小管上皮细胞表性转化及骨形态形成蛋白与肾脏纤维化的关系及其影响:
• 4.1.4 慢性肾脏病（CKD）中医证型的相关研究肾小管间质损伤的发生机理:
• 4.1.5 肾小管间质纤维化的中医药治疗研究进展:
• 4.1.6 我科对于TIF的中医证候研究:
• 4.1.7 益肾缓衰方的相关研究成果:
• 5.实验部分:
• 5.1 前言:
• 5.2 材料与方法:
• 5.2.1.材料:
• 5.2.1.1 实验药物:
• 5.2.1.2 实验动物:
• 5.2.1.3 实验试剂及仪器:
• 5.2.2 方法:
• 5.2.2.1 实验分组:
• 5.2.2.2 实验造模:
• 5.2.2.3 给药方法:
• 5.2.3 观察指标及检测方法:
• 5.2.3.1 肾功能:
• 5.2.3.2 病理观察:
• 5.2.3.3 免疫组化法
• 5.2.4 统计学方法:
• 5.3 实验结果:
• 5.3.1 肾脏病理:
• 5.3.1.1 肉眼观察:
• 5.3.1.2 光镜可见:
• 5.3.2 肾功能的变化:
• 5.3.3 免疫组化结果:
• 5.3.3.1 α-SMA在假、模、阳、中各组的表达:
• 5.3.3.2 BMP-7在假、模、阳、中各组的表达:
• 6 结论:
• 7 讨论:
• 8 参考文献:
• 9 致谢:
• 10 个人简历: