原卟啉原氧化酶催化机理及其抑制动力学的研究

论文摘要

原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, Protox/PPO, EC 1.3.3.4）是叶绿素和亚铁血红素相同生物合成步骤中的最后一个酶,其广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。在原卟啉原氧化酶的催化作用下,无色的原卟啉原IX被氧化,失掉六个电子生成共轭的光敏性物质原卟啉IX。研究表明原卟啉原氧化酶定位在叶绿体和线粒体中,对于叶绿素和亚铁血红素的合成具有重要的作用,这就决定了它在生命体系中具有重要的意义。在人体中,该酶的缺损会造成显性遗传疾病——混合型卟啉症（Variegated Porphyria, VP）的产生,这种病又称杂色卟啉病,为一种常染色体显性遗传疾病。这种疾病患者的数量和发病地域正在不断扩大,因此对该酶的研究具有重要的医学意义。在植物体内,原卟啉原氧化酶是光依赖性除草剂的作用靶标,除草剂与底物竞争性抑制的结果会导致绿色植物组织的干枯与白化,从而死亡。这在研发新型的抑制剂上引起了农药学家的关注,因而对该酶的研究具有重要的农学意义,我们希望从酶水平利用分子生物学手段,研究抑制剂与酶的作用机制,从而指导新型抑制剂的合成与研发。基于原卟啉原氧化酶在医学和农学中的重要性,我们主要进行了以下四方面的工作：一、通过对多种蛋白晶体培养条件的摸索优化,对人体PPO晶体进行培养,得到了分辨率为1.9A的人体PPO与其抑制剂三氟羧草醚（AF）的复合物晶体结构,为理解人体混合型卟啉症的发病机制和PPO催化机理的研究提供了重要的结构信息。二、在结构和模拟计算支持的前提下,识别了在人体PPO活性空腔中对催化过程有重要作用的氨基酸残基,采用Dpn I突变方法建立了基因突变体系,并对其活性进行测定,验证了这些氨基酸残基的重要性。三、对原卟啉原氧化酶的氧化机理进行了进一步的研究,并且采用stopped-flow的方法测得了02加速酶反应的速率常数,提出了PPO新的催化氧化机制。四、通过高通量筛选对PPO类抑制剂的抑制动力学进行了研究,寻找出了活性更高的化合物,在这些化合物结构的基础上,通过计算机模拟对不同官能团的影响进行总结,对高效新型抑制剂的研发具有指导意义。综上所述,本文从结构生物学的角度对人体原卟啉原氧化酶进行研究,所得到的实验结果对抑制剂的分子设计和VP卟啉症的研究具有指导作用。在此基础上结合计算化学对原卟啉原氧化酶与底物、抑制剂、辅助因子之间的相互作用进行了研究。本文通过对抑制剂合理的分子设计和高通量筛选,为设计高效专一、开发新型抑制剂提供重要的理论指导和新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 研究背景介绍
• 1.1 原卟啉原氧化酶概述
• 1.1.1 原卟啉原氧化酶的作用及其在细胞中的定位
• 1.1.2 原卟啉原氧化酶的亚基组成
• 1.1.3 原卟啉原氧化酶的辅酶
• 1.1.4 原卟啉原氧化酶的底物
• 1.2 原卟啉原氧化酶的活性测定
• 1.2.1 原卟啉原氧化酶催化的反应
• 1.2.2 原卟啉原氧化酶的活性测定原理
• 1.2.3 底物原卟啉原Ⅸ的制备
• 1.2.4 底物原卟啉原Ⅸ的定量
• 1.2.5 原卟啉原氧化酶反应动力学
• 1.2.6 原卟啉原氧化酶抑制动力学
• 1.3 原卟啉原氧化酶的反应机理研究
• 1.4 原卟啉原氧化酶的晶体结构研究
• 1.4.1 烟草线粒体原卟啉原氧化酶的晶体结构
• 1.4.2 粘球菌Myxococcus xanthus原卟啉原氧化酶的晶体结构
• 1.4.3 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis原卟啉原氧化酶的晶体结构
• 1.4.4 微小细菌Exiguobacterium sp.255-15原卟啉原氧化酶的晶体结构
• 1.4.5 人体原卟啉原氧化酶的晶体结构
• 1.4.6 种属间原卟啉原氧化酶晶体结构的比较
• 1.5 原卟啉原氧化酶的医学和农学研究
• 1.5.1 原卟啉原氧化酶的医学研究
• 1.5.2 原卟啉原氧化酶的农学研究
• 1.6 本文的研究目的和主要内容
• 第二章 人体原卟啉原氧化酶及其突变体的研究体系
• 2.1 人体原卟啉原氧化酶介绍
• 2.1.1 人体原卟啉原氧化酶的基本性质
• 2.1.2 人体原卟啉原氧化酶的研究价值
• 2.2 人体原卟啉原氧化酶的表达和纯化
• 2.2.1 实验仪器与材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 实验结果与小结
• 2.3 人体原卟啉原氧化酶的活性测定研究
• 2.3.1 实验仪器与试剂
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.3 实验结果与小结
• 2.4 人体原卟啉原氧化酶晶体培养
• 2.4.1 实验仪器和材料
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.3 实验结果和小结
• 2.5 人体原卟啉原氧化酶及其突变酶的相关性质研究
• 2.5.1 突变体系的建立
• 2.5.2 实验结果与小结
• 第三章 原卟啉原氧化酶氧化机理的研究
• 3.1 研究对象的选择
• 2在PPO催化反应中的作用'>3.2 O₂在PPO催化反应中的作用
• 3.2.1 原卟啉原氧化酶催化机理的新认识
• 3.2.2 利用荧光实时监测酶反应
• 3.2.3 利用stopped-flow测定酶反应的速率常数
• 第四章 原卟啉原氧化酶抑制动力学的研究
• 4.1 原卟啉原氧化酶抑制剂简介
• 4.2 原卟啉原氧化酶商品化除草剂抑制动力学研究
• 4.2.1 实验目的
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果与讨论
• 第五章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录A 人体原卟啉原氧化酶突变体测序结果比对图
• 附录B 氨基酸的结构和中英文名称及简写符号
• 附录C 氨基酸密码子表
• 附录D FAD与三氟羧草醚的结构
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文和研究成果
• 致谢