论文题目: 基于纳米颗粒的植物转基因及其检测研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 分析化学
作者: 刘俊
导师: 刘选明
关键词: 纳米颗粒,基因载体,基因转导,转基因植物,分子信标,基因检测
文献来源: 湖南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 纳米颗粒作为基因载体和药物载体在动物细胞的研究中取得了初步进展,这是纳米生物技术所取得的主要成果之一。但是,纳米生物技术在植物生命活动中研究相对较少,有待开发其潜在的应用价值。因此,本研究以具有生物相容性的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(poly-L-lysine starch nanoparticle,PLL-StNP)为基因载体进行了植物转基因技术的研究,并就该技术相关的基础性科学问题进行了初步探讨,同时,将纳米颗粒与分子信标(molecular beacon, MB)结合,对目标基因及其表达进行活体、实时、超灵敏检测的研究,以实现在纳米尺度和单分子水平上获取生命活动过程的信息。通过研究,建立了基于纳米颗粒的植物转基因及其检测的新方法。1.纳米颗粒基因载体的制备及其特性纳米颗粒基因载体的制备:以可溶性淀粉为原料,制备了淀粉纳米颗粒(starch nanoparticles, StNPs)。以该纳米颗粒为内核,经多聚赖氨酸修饰,得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNPs)。在原子力显微镜下检测到这些颗粒的大小为50 nm左右,分散均匀。在pH 7-8的范围内,PLL-StNPs带正电荷。纳米颗粒与DNA的结合:在PLL-StNPs溶液中加入质粒DNA,凝胶电泳分析,PLL-StNPs能有效结合DNA,而且PLL-StNPs能同时结合不同种类的DNA。洗脱复合物中的DNA,凝胶电脉分析,DNA条带没有改变,说明DNA能结合在PLL-StNPs上,也能从复合物上分离,因此,PLL-StNPs可用作多基因载体。将PLL-StNPs进行RuBPY修饰, RuBPY修饰的NPs仍能有效结合DNA。纳米颗粒对DNA的保护作用:结合了DNA的NPs在超声波发生器中处理不同的时间后,进行凝胶电泳分析发现DNA仍与NPs结合。洗脱复合物中的DNA,经电泳发现DNA条带没有改变,表明NPs能有效地保护DNA防止超声波的破坏。用DNase I消化DNA-NPs复合物,洗脱复合物中的DNA,进行凝胶电泳分析,发现DNA条带均没有改变,实验结果表明DNA-NPs能较好地保护DNA防止DNase I的酶切。纳米颗粒与植物细胞的生物相容性:在高渗作用或超声波介导下,将RuBPY修饰的PLL-StNPs导入盾叶薯蓣细胞,在激光共聚焦显微镜下观察发现,荧光纳米颗粒进入了植物细胞,主要分布在细胞质中,随着培养时间的延长,细胞中荧光纳米颗粒数目减少,荧光强度也减弱; 将有荧光纳米颗粒的细胞培养3~5天,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中仍有荧光,但荧光的强度随着时间的延长而减弱,同时可在分裂的子细胞中观察到微弱的荧光。说明NPs能有效进入植物细胞,
论文目录:
摘要
Abstract
英文缩写词表
第1章 绪论
1．1 纳米基因载体的研究进展
1．1．1 生物纳米技术的基本概念
1．1．2 纳米颗粒基因载体的特点
1．1．3 纳米颗粒基因载体的构建
1．1．4 纳米颗粒基因载体的种类
1．1．5 提高纳米颗粒基因载体转导效率的方法研究
1．2 植物转基因及其检测的研究进展
1．2．1 植物转基因的研究进展
1．2．2 植物转基因检测的研究进展
1．3 纳米技术在生物活体、实时检测中的应用研究
1．4 本研究的目的与意义以及拟开展的论文研究工作
1．4．1 本研究的目的与意义
1．4．2 拟开展的论文研究工作
第2章 纳米基因载体的制备及其特性
2．1 引言
2．2 材料与方法
2．2．1 实验材料
2．2．2 实验方法
2．3 结果与讨论
2．3．1 淀粉纳米颗粒(StNP)的制备
2．3．2 多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-StNP)的制备和表征
2．3．3 钌吡啶(RuBPY)修饰的PLL-StNP 的制备和表征
2．3．4 PLL-StNP 的稳定性
2．3．5 PLL-StNP 的生物降解性
2．3．6 PLL-StNP 与DNA 的结合特性
2．3．7 PLL-StNP 对DNA 的酶切保护特性
2．3．8 PLL-StNP 保护DNA 防止超声波破坏的特性
第3章 纳米颗粒与植物细胞的生物相容性
3．1 引言
3．2 材料与方法
3．2．1 实验材料
3．2．2 实验方法
3．3 结果与讨论
3．3．1 盾叶薯蓣愈伤组织的诱导与生长
3．3．2 盾叶薯蓣悬浮细胞的制备
3．3．3 荧光纳米颗粒在植物细胞中的代谢
第4章 基于纳米颗粒的单基因转导
4．1 引言
4．2 材料与方法
4．2．1 实验材料
4．2．2 实验方法
4．3 结果与讨论
4．3．1 感受态植物细胞的制备
4．3．2 纳米颗粒基因载体的构建
4．3．3 超声波对植物细胞生长的影响
4．3．4 超声波介导纳米颗粒的基因转导
第5章 基于纳米颗粒的多基因转导
5．1 引言
5．2 材料与方法
5．2．1 实验材料
5．2．2 实验方法
5．3 结果与讨论
5．3．1 发根农杆菌的转化效果
5．3．2 纳米颗粒多基因载体的转化效果
5．3．3 毛状根的分子鉴定
第6章 基于纳米分子探针检测转基因植物
6．1 引言
6．2 材料与方法
6．2．1 实验材料
6．2．2 实验方法
6．3 结果与讨论
6．3．1 纳米颗粒结合分子信标体外检测rolB 基因
6．3．2 纳米颗粒结合分子信标体内检测rolB 基因
第7章 转基因植物的有效成分分析
7．1 引言
7．2 材料与方法
7．2．1 实验材料
7．2．2 实验方法
7．3 结果与讨论
7．3．1 盾叶薯蓣毛状根培养体系的建立
7．3．2 薯蓣皂甙元含量的测定
第8章 结论
8．1 本研究工作的结论
8．2 本研究工作的创新点
8．3 展望
参考文献
致谢
附录A 攻读学位期间所发表的学术论文
发布时间: 2006-05-10
参考文献
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