导读:本文包含了中和单抗论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:斑块状银屑病,IL-17F,Bimekizumab,白细胞介素
中和单抗论文文献综述
沈盛县[1]（2019）在《Bimekizumab单抗双重中和白细胞介素-17A和IL-17F治疗中重度斑块状银屑病》一文中研究指出银屑病是一种T淋巴细胞过度活化和功能紊乱的自身免疫性疾病,其中Th17细胞特异性表达白细胞介素(IL)-17A和IL-17F。IL-17A具有强大的致炎活性,能促进机体产生趋化因子,促使单核细胞、中性粒细胞数量迅速增多,也能刺激炎性细胞产生炎性因子,增强局部炎症反应。IL-17F与IL-17A结构相似,具有相同的受体,在体内外能产生强大的致炎效应。最近有临床研究表明,bimekizumab单抗可同时中和IL-17A和IL-17F,从而更(本文来源于《实用皮肤病学杂志》期刊2019年03期）
刘梦莹[2]（2019）在《美洲型PRRSV GP4蛋白中和单抗的制备及其抗原表位鉴定》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,我国发现的位于PRRSV 5亚群的PRRSV类NADC30株自2013年以来广泛流行。PRRSV的糖蛋白GP4在PRRSV感染以及产生中和抗体过程中发挥重要作用,但对于具有中和活性GP4 MAb的制备与研究却鲜有报道。本研究目的是制备具有中和活性的PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体(MAb)并鉴定出MAb识别的抗原表位,对了解PRRSV基因组的结构与功能,以及进一步利用中和单抗对PRRS进行免疫防治具有非常重要的意义。本研究用纯化的PRRSV SD53株病毒免疫6周龄的BALB/c雌鼠叁次,第叁次免疫7天后,经IFA检测结果显示小鼠血清全部转阳。取血清已经转为阳性的小鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合。经四次亚克隆,并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证,结果表明成功获得一株能够稳定分泌抗PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株,命名为LM26;对所获得的阳性杂交瘤细胞大量培养,并以这株细胞制备腹水,收集制备的腹水,经亲和层析纯化,western blot分析结果表明,已经获得了纯化后的MAb。IFA测定MAb LM26的细胞培养上清及腹水的效价为1:16和1:1600。该MAb对北美洲型PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最低为1:6,最高为1:50。该MAb亚型为IgG2a亚类,轻链为κ链。本研究进一步明确了LM26为抗PRRSV GP4单抗,并精确鉴定其识别的抗原表位。首先,将PRRSV SD53株一系列结构蛋白的核酸序列扩增后回收,利用两个核酸内切酶切开,并将回收后的片段连入到pGEX-6P-1表达的载体中,把一系列重组表达的质粒构建出来,利用这些质粒,进行重组蛋白的诱导和表达,获得了一系列表达的结构蛋白短肽与GST的融合蛋白。western blot结果显示,一系列重组蛋白均成功表达,且LM26仅与PRRSV重组表达后的GP4蛋白能够特异性的结合。其次,将测序正确后的质粒pCAGGS-FLAG-GP4瞬时转染到293T细胞作为检测抗原,用IFA验证已经成功表达的重组GP4蛋白与LM26反应,证明抗PRRSV GP4 MAb已经被成功的制备。最后,对该MAb识别GP4蛋白上抗原表位进行鉴定,western blot结果显示LM26识别GP4蛋白的aa 57~aa 62(~(57)VVLQDI~(62))。将序列~(57)VVLQDI~(62)与在GenBank中下载的28株国内外PRRSV株GP4氨基酸序列比对,结果显示,位于GP4蛋白的aa 57~aa 62这段序列,在HP-PRRSV株以及类NADC30 PRRSV株中呈现高度保守;在经典PRRSV株中存在2个突变位点,分别是V~(57)A和Q~(60)H;在欧洲PRRSV株中存在1个突变位点V~(57)M。然而,IFA检测结果显示,LM26与疫苗株HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92反应,与欧洲株DV、VP046BIS不反应,由此推测V~(57)A、Q~(60)H突变不影响LM26对抗原表位的识别,该表位在美洲型PRRSV中相对保守。综上所述,本研究成功制备出一株具有中和活性的抗PRRSV GP4蛋白MAb,并鉴定了其识别表位位于GP4蛋白~(57)VVLQDI~(62),该MAb有助于进一步研究PRRSV基因组的结构和功能。(本文来源于《福建农林大学》期刊2019-06-01）
张秀娟,李磊,付楚溪,汪建华,熊向华[3]（2018）在《A型肉毒毒素鼠源中和单抗的制备与鉴定》一文中研究指出目的制备并鉴定A型肉毒毒素(Bo NT/A)鼠源中和单克隆抗体。方法利用Bo NT/AHc抗原免疫小鼠筛选得到的55株杂交瘤细胞培养上清,通过小鼠中和实验(MNA)选出中和活性较高单抗,进行抗体分型并扩增抗体可变区基因;利用BALB/c小鼠制备腹水,通过辛酸-硫酸铵以及Protein-G亲和层析纯化,并进行ELISA、SDS-PAGE、Western印迹、截短实验、BIAcore、中和活性及中和剂量分析。结果筛选得到1株中和活性较高的小鼠单抗BAS51,其轻链为κ、重链为Ig G1,获得轻、重链可变区序列;小鼠腹水效价为7. 29×105,纯化抗体纯度> 95%;BAS51与抗原Bo NT/AHC亲和力常数为1. 53×109L/mol,可与HCC片段结合,为线性表位,中和活性为100 LD50/mg,中和剂量为66. 7 LD50/mg。结论得到1株具有较强中和活性的抗Bo NT/A小鼠源单抗,为A型肉毒毒素中和抗体的研发奠定了基础。(本文来源于《军事医学》期刊2018年09期）
乔佳明[4]（2018）在《人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp120制备及中和单抗筛选》一文中研究指出获得性免疫缺陷综合症(AIDS),即艾滋病,由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体引起,导致机体免疫系统功能障碍,进而引发各种并发症的疾病。自1981年HIV被发现至今已经将近四十多年的历史,但目前依然没有有效的疫苗或者药物能够彻底预防和治愈艾滋,而且全球HIV感染者病例每年仍在增长。截止2016年底,全球约有3670万人感染HIV,同时在2016年全球约有100万人死于艾滋相关的疾病。因此,研制HIV的疫苗或药物成为迫在眉睫的艰巨任务。随着人们对HIV病毒深入认识,对于HIV疫苗的研究,人们从最初单纯倾向于依赖机体细胞免疫反应或者单纯依赖体液免疫来产生广谱中和抗体,这两个方向来进行HIV疫苗的研究,到现在人们在之前失败的经验中,认识到必需同时结合细胞免疫和体液免疫才能够有希望研制出安全有效的HIV疫苗。近些年的研究也表明,HIV病毒在人体内的清除过程,除了依赖细胞免疫,同时更重要的是机体能够产生广谱中和抗体。而且人们也认识到,HIV-1的膜蛋白gp120是广谱中和抗体的主要中和表位。本研究中,将7种不同型别的HIV-1gp120蛋白基因序列,包括NL4-3-gp120、89.6-gp120、3074-gp120、MJ4-gp120、94UG144-gp120、3088-gp120、3096-gp120,构建于昆虫细胞杆状病毒表达载体pAcgp67B上,成功克隆构建pAc-gp120重组表达质粒。然后通过该昆虫细胞杆状病毒表达系统,成功高效表达,并运用SDS-PAGE、WesternBlot、酶联免疫吸附试验、分析超离、分子筛等方法,对gp120的理化性质进行了鉴定。然后,利用NL4-3-gp120蛋白,辅以弗氏佐剂,以100μg/只的剂量,两周时间为免疫周期,对6周龄Balb/C雌鼠进行免疫。同时,每次免疫前采集小鼠血清,通过ELISA和Tzm-b1细胞中和实验监测小鼠血清中抗体的结合和中和滴度。在获得中和滴度较高的免疫小鼠后,基于Tzm-b1细胞的中和实验,进行单克隆抗体的融合筛选。本研究中,成功筛选获得9株中和抗体,其中8株是针对实验室适应株NL4-3型别病毒的抗体,10G6则是筛选到的一株较为广谱的中和抗体。之后,运用Western Blot、酶联免疫吸附试验、中和实验、免疫荧光、丙氨酸扫描等方法,对这些中和单抗进行性质鉴定。结果显示,10G6这株单抗是受糖蛋白糖修饰类型影响的,识别gp120V3区的广谱中和抗体。综上所述,本研究利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,成功获得HIV-1gp120蛋白,并通过该蛋白免疫小鼠,成功筛选到8株型特异性中和抗体和1株较为广谱的中和单抗10G6。这表明gp120蛋白具有较好的免疫原性,单纯同一型别gp120蛋白免疫,能够诱导机体产生具有广谱中和能力的抗体。这为今后基于广谱中和表位的疫苗研究以及免疫原的设计奠定了一定的基础。(本文来源于《厦门大学》期刊2018-04-01）
陈红霞,李雪,罗涛,李乐,于玉根[5]（2017）在《重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中和抗体确证方法的建立》一文中研究指出目的:建立一种快速、灵敏、高效和易操作的方法,用于检测重组人源化抗TNF-α单抗WLB303猴重复给药毒性试验血清中产生的中和抗体。方法:对食蟹猴静脉输注WLB303,连续给药4周。采取给药期和恢复期不同时间的血清,随后采用桥式酶联免疫吸附法对血清中的抗药抗体进行定性筛选,对筛选为阳性的血清样本进行预处理,然后以WLB303生物学活性测定法为基础的中和反应法对中和抗体进行确证。结果:建立了WLB303中和抗体的确证方法,确定了检测的临界点。确证方法的检出率为100%,在血清中检测到具有中和活性的抗体,中和抗体的中和作用强度总体与给药时间、给药剂量呈正相关。结论:建立的检测方法能够直接体现出剂量差异性和个体差异性,也能反映中和抗体的滴度差别。该方法的特异性、灵敏度和有效性能够满足试验要求,可以用于单抗药物重复给药动物毒性试验血清中和抗体的检测。(本文来源于《中国新药杂志》期刊2017年20期）
黄立平,刘长明,Hans,Nauwynck[6]（2017）在《猪圆环病毒2型衣壳蛋白氨基酸的突变影响病毒与中和性单抗的反应特性和病毒的繁殖特性》一文中研究指出研究背景:猪圆环病毒2型(PCV2)可以引发多种疾病,统称PCV2相关疾病,疫苗免疫是控制PCV2感染有效的方法。PCV2衣壳蛋白即Cap蛋白是PCV2唯一结构蛋白,该蛋白诱导的中和抗体在疫苗免疫过程中起到主要的抗病毒作用。硫酸肝素和硫酸皮肤素是PCV2的受体,BBXB、XBBXBX和XBBBXXBX(B代表碱性氨基酸,X代表其他氨基酸)被认为是肝素绑定基序。人乳头瘤病毒31型硫酸肝素结合位点中的赖氨酸参与中和构象表位的组成,那么PCV2 Cap蛋白表面的碱性氨基酸也有可能参与PCV2构象中和表位和肝素结合位点的组成。研究目的:利用PCV2感染性克隆和突变技术研究PCV2 Cap蛋白表面碱性氨基酸对中和性单抗反应特性和病毒繁殖特性的影响。研究方法和结果:采用点突变技术将位于PCV2病毒表面的碱性氨基酸分别突变成丙氨酸,并利用感染性克隆技术拯救突变毒株和亲本毒株,分别命名为:mutant K58A、mutantR59A、mutant K63A、mutant R73A、mutant K132A、mutant R186A和mutant K227A。通过IPMA鉴定这些突变毒株与单抗的反应特性,结果显示mutant K63A获得了与31D5和59C6的反应特性;mutant K132A和mutantK227A也获得了与108E8的反应特性,同时mutant K227A也丧失了与13H4的反应特性;mutant K58A在获得与59C6反应特性的同时也丧失了与19G10的反应特性;而mutant R59A丧失了与单抗114C8和9C3的反应特性。同源建模结果显示:影响PCV2IPMA反应特性的氨基酸空间上非常靠近,位于衣壳五倍体对称的周围和叁倍体对称轴的远端。病毒传代和毒价测定结果显示:mutant K58A、mutant K63A、mutant R73A、mutant R186A和mutant K227A的复制能力不同程度的降低,同源建模结果显示:这几个碱性氨基酸空间上比较靠近,与周围的氨基酸组合成两个疑似的硫酸肝素结合区域,由此可以推测,~(58)K、~(63)K、~(73)R、~(186)R和~(227)K可能参与PCV2受体结合位点的组成。结论:PCV2 Cap蛋白表面的~(58)K、~(63)K、~(73)R、~(186)R和~(227)K既能影响PCV2与中和性单抗的反应特性又可以影响病毒的繁殖,因此这几位点参与该病毒构象中和表位或者边缘结构的关键氨基酸。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）
杨超[7]（2017）在《人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp140在哺乳动物细胞中的高效表达、性质鉴定及中和单抗的筛选》一文中研究指出艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征。艾滋在世界范围内流行,其中主要是1型HIV病毒给人类健康带来严重威胁。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,自从HIV被发现以来,被感染者已逾7千万人,2015年底全球仍有3千6百多万艾滋患者,15岁至49岁成人HIV感染率高达0.8%[1]。2012至2014年连续叁年,我国艾滋病发病超过4万人/年[2]。目前高活性抗逆转录病毒治疗(Highly Active AntiretroViral Therapy,HAART)已经可以抑制艾滋感染者体内病毒的复制,延长患者寿命并使其可以像健康人一样正常生活。然而抗逆转录药物需要每天服用,37.74%的服药患者出现消化道反应、肝功能异常等副作用[3],而且HAART治疗不能从根源上斩断艾滋的流行,疫苗的研发正是当务之急。HIV-1包膜糖蛋白(envelope glycoprotein,Env)gp160 在成熟过程中水解为 gp120(surface glycoprotein,SU)和gp41(transmembrane protein,TM),这两个蛋白单体通过非共价键结合为异源二聚体,叁个二聚体组装成成熟的叁聚体刺突铆定在病毒包膜上。病毒入侵宿主细胞时,gp120上的CD4结合位点识别CD4细胞表面受体分子,引发Env变构靠近细胞膜从而发生膜融合,因此包膜蛋白是阻止病毒感染的重要切入点,也是疫苗研究的重要靶点[4]。广谱中和单抗N6,VRC01,b12,2F5等抗体分别针对gp120上的CD4结合位点和 gp41 上的近膜外区(Membrane Proximal External Region,MPER),能够实现对多种型别病毒的高效中和[5,6,7,8]。然而根据这些抗体表位设计的疫苗仍未取得理想的效果。RV144是第一个被证实具有降低HIV-1感染效果的疫苗。实验中,表达 E 亚型 Env 和 B 亚型 Gag(group specific antigen)、Pro(protease)的金丝雀痘病毒载体为初免,B/E亚型gp120和铝佐剂加强免疫,叁年半后受试者仍保持31.2%的疫苗保护率[9]。体内具有高水平阻断和结合抗体,可能对艾滋感染有保护作用[9]。另有文献报道,通过对BG505毒株的Env进行改造,可以实现体外的可溶性表达,得到近似天然的蛋白叁聚体[10]。重组包膜蛋白BG505 SOSIP.664和B41 SOSIP.664均可在兔子体内诱导得到较强的广谱中和抗体[11]。这些报道对艾滋疫苗的进一步研究提供了新的方向和信心。本研究的目的是通过优化HIV-1 gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现gp140蛋白在哺乳动物细胞HEK293中高效表达,并对纯化获得的蛋白进行抗原性质鉴定。本研究选择B亚型HIV-1 NL4-3基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性连接、叁聚体辅助折迭序列等方法优化设计,确定了最终的重组克隆SOSIP(G4S)2 663CO-T4his用于蛋白表达和性质鉴定。此外我们验证了 HIV-1转录反式激活因子(Transactivator of Transcription,Tat)共转HEK293T细胞对gp140蛋白表达的促进作用,并摸索得到最佳的Tat/gp140共转比例。镍柱纯化后,每升培养基可获得0.5mggp140蛋白,目的蛋白纯度约为70%。通过ELISA鉴定发现该重组蛋白具有良好的抗原活性,电镜下呈现均匀的叁聚体结构。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,随着免疫次数增加小鼠血清中和能力逐渐提高,并最终筛选得到10株针对NL4-3毒株的中和单抗,其中两株具有型间交叉中和能力。本研究对B亚型HIV-1NL4-3gp140进行改造、优化转染条件,获得了 gp140叁聚体在体外的高效表达,并对其抗原性和免疫原性进行了鉴定,探索了 HEK293系统表达gp140作为重组蛋白疫苗的可行性,为HIV-1包膜蛋白结构研究、疫苗和药物设计奠定基础。(本文来源于《厦门大学》期刊2017-04-01）
邵佳[8]（2017）在《人免疫缺陷病毒包膜蛋白第叁可变区V3融合蛋白的免疫原性分析及中和单抗的筛选》一文中研究指出获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种以机体免疫系统严重损害为主要特征的传染性疾病,人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染是AIDS的基础。2015年为止,HIV全球感染人数达到3670万,严重危害人类健康。迄今为止,仍无保护性疫苗或能彻底清除HIV病毒的药物出现。因此研究安全有效的疫苗和抗病毒药物对于预防和治疗HIV有重大意义。自2009年以来,有大量强效广谱中和抗体和相应表位被报道,动物模型以及RV144疫苗的保护效果都证明诱导机体产生广谱中和抗体是疫苗设计的关键。HIV-1包膜糖蛋白gp120第叁可变区(V3)对病毒的感染至关重要,在前期的研究中,我们通过HIV病毒免疫筛选到了特异针对HIV毒株NL4-3 V3表位的中和抗体,本研究将V3中和表位展示在CRM197-A和HPV-VLP上,评估V3中和表位的免疫原性和研究开发表位疫苗的可能性,进而为预防性疫苗和治疗性抗体的研究提供基础。在本研究中,我们将不同长度,不同型别的V3中和表位展示在CRM197-A和HPV-VLP上融合表达,通过中和实验和酶联免疫吸附实验(ELISA)评估小鼠体液免疫效果。基于实验室成熟的小鼠单克隆抗体筛选平台,利用基于免疫斑点印迹法(ELISPOT)的HIV中和抗体筛选平台筛选单克隆抗体,通过中和实验和ELISA对单抗进行性质分析。通过对小鼠血清监测结果和单抗性质分析,综合评价V3中和表位的免疫原性,进一步探索开发表位疫苗的可能性。在研究过程中,将不同长度,不同型别的V3中和表位融合CRM197-A和HPV-VLP为免疫原,血清监测结果显示CRM197-A-NL4-3-299-328和HPV-NL4-3-296-311融合蛋白免疫血清对HIVNL4-3有中和效果。CRM197-A-NL4-3-299-328融合蛋白免疫小鼠筛选到8株特异中和HIVNL4-3的中和单抗,其IC50大部分低于0.02μg/mL,是强效的型特异性中和单抗。HPV-NL4-3-296-311融合蛋白免疫小鼠筛选到20株中和单抗,其中和能力不一,大部分单抗能够结合不同型别的HIV包膜蛋白gp120,具有交叉亲和的效果。其中单抗4H4具有交叉中和的效果,对实验室现有毒株HIVNL4-3,HIV89.6,HIVMJ4,HIV94均有中和效果,IC50为12-15μg/mL。综上,本研究中,V3中和表位融合蛋白刺激小鼠产生高中和效价,筛选到了型特异性强效中和抗体,同时也有交叉中和抗体的产生,表明V3中和表位融合蛋白具有强的免疫原性,有诱导产生广谱中和抗体的潜力,为后续诱导广谱中和抗体抗原的设计和表位疫苗的研究提供基础。(本文来源于《厦门大学》期刊2017-04-01）
张燕红,路荣,刘国英,范秀丽,任旭荣[9]（2017）在《用细胞中和法测定单抗效价》一文中研究指出本研究旨在利用细胞中和实验方法测定单克隆抗体是否具有中和病毒的活性。利用细胞中和法测定两株包被(捕获)单克隆抗体3D7(含O/Mya98/XJ/2010株抗体)和7G3(舍O/GX/09-7株抗体)对不同病毒的中和抗体值,验证这两株单抗是否具有中和病毒的活性。结果表明:7G3可以中和O/GX/09-7株病毒,但不能中和其他毒株病毒,虽然中和能力不强,但是特异性中和,进一步验证该抗体仅与O/GX/09-7株反应:3D7仅与缅甸98株发生特异性结合反应,与其他毒株均不产生反应,而且中和效价达1:128,属于具有中和能力的单抗抗体。(本文来源于《国外畜牧学(猪与禽)》期刊2017年03期）
张梦雄[10]（2016）在《基于单B细胞的汉坦病毒全人源中和单抗的研制》一文中研究指出肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒引起的急性传染性疾病,在世界范围内广泛流行,疫源地分布于5大洲70多个国家,已成为世界公共卫生问题。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家,年报告发病人数约为4万-6万,占世界报告病例总数的90%以上。HFRS严重危害人民的生命健康安全,是我国重点防治的急性传染病之一。近些年来合并较多并发症的HFRS病例在临床上越来越多地出现,这些病例极易进展至多器官功能衰竭、颅内出血和弥散性血管内凝血,这些亦是该病导致死亡的主要原因,因此虽然近几年肾综合征出血热的年发病率有所下降,但针对该病的防控形势却越来越严峻。目前市场上还没有肾综合征出血热的特效治疗药物,临床上主要以对症治疗为主。研究表明抗汉坦病毒中和抗体可以快速有效地中和体内的汉坦病毒,达到治疗的目的,所以通过抗汉坦病毒中和抗体治疗肾综合征出血热,已经成为国内外临床医学和生物制药专家的共识。本实验尝试利用基于单细胞PCR技术的全人源单克隆抗体制备技术,进行抗汉坦病毒全人源中和抗体的研制。首先采集了4名肾综合征出血热患者的恢复期外周血共80m L,通过密度梯度沉降法,从这些外周血中分离出淋巴细胞。然后根据B细胞表面分子标记特征对分离的淋巴细胞进行荧光标记,通过流式细胞分选仪分选CD3-/CD20-/CD19+/C D27+/CD38+的单个浆细胞,共分选获得2200个B淋巴细胞。接下来分两步从单个B细胞中扩增抗体基因。由于单B细胞中的抗体基因序列是未知的,而抗体基因又具有丰富的亚型,因此第一步以覆盖绝大部分抗体可变区基因家族的18条引物进行RT-PCR,在一个反应体系中同时扩增单个B细胞中抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因;第二步再以RT-PCR的产物做为模板,分叁个反应体系进行巢式PCR,分别扩增H链、κ链以及λ链可变区基因,重链扩增VDJ重链基因区段,轻链扩增VJ轻链基因区段,混合引物包括针对每一个抗体可变区基因家族的特异引物。最终从2200个单个B淋巴细胞中获得了427个H链可变区基因片段、880个κ链可变区基因片段458个λ链可变区基因片段,阳性比例分别为20%、40%和21%,轻链中κ链和λ链的占比分别为66%和34%,基本符合人的表达κ链和λ链的B细胞的比例,其中轻重链基因天然配对且唯一的抗体基因是130对。获取抗体基因后需要进行抗体表达和筛选,但是传统构建表达载体转染哺乳动物细胞表达抗体的方式费时费力,为了加速初期筛选,我们尝试利用线性表达框表达130对抗体基因。构建线性表达框时将CMV启动子、抗体信号肽序列、抗体轻/重链的可变区基因序列、抗体轻/重链恒定区序列和poly A信号序列等转录翻译必需元件通过一步重迭延伸PCR构建成一个完整的线性片段,将轻/重链线性片段共转染HEK-293悬浮细胞,130个抗体中120个获得表达,与传统的克隆方法相比,通过线性表达框表达抗体,大大降低了工作量,在3-4天内便可获得可用于后续筛选的抗体。线性表达框表达抗体的水平多数可以达到1.2μg/m L以上,可以满足抗体特异性筛选的需要。随后以灭活的汉坦病毒作为抗原,通过ELISA对成功表达的抗体进行了特异性检测,结果显示,120个单抗中有51个可以特异性结合灭活的汉坦病毒,占42.5%。随后我们从这51个单抗中挑选30个特异性较高的单抗,将其轻重链构建到表达载体中,并瞬时转染到HEK-293悬浮细胞中进行表达纯化,30个都获得了表达,纯化后抗体浓度在0.5-1.2mg/m L之间。抗体中和活性检测我们采用的是荧光抗体病毒中和试验,通过FITC标记的抗汉坦病毒单抗检测病毒感染的细胞定量病毒,进而判断单抗的中和作用。通过检测我们筛选到2个具有中和活性的抗体(20C8、11H11),两者中和效果都存在剂量依赖关系,其中11H11中和作用明显强于20C8,0.16μg的11H11可以中和70%200 TCID50病毒,而中和同样的病毒需要0.64μg的20C8。以灭活的汉坦病毒作为抗原,采用ELISA方法初步测定抗体与抗原的结合力,20C8的结合EC50约为8.3×10-8 mol/L,11H11的结合EC50约为1.8×10-6 mol/L。汉坦病毒结构蛋白G1和G2蛋白是两个主要的中和抗原,预期以这两个蛋白作为抗原筛选特异性抗体,分别用HEK-293悬浮细胞和毕赤酵母表达这两个蛋白的膜外区,结果在毕赤酵母中G2蛋白有少量表达,而G1没有检测到表达产物;G1和G2在HEK-293悬浮细胞中都可以实现表达,但是G1和G2主要存在于细胞膜上,没有分泌到细胞外。汉坦病毒中和抗原G1/G2的表达一直是世界性难题,后续需要在现有工作基础上开展进一步研究,为确定20C8和11H11的抗原表位,并深入评价这两株抗体的亲和力和特异性奠定基础。利用本课题所建立的单B细胞全人源抗体制备技术,可以从传染病患者或者疫苗免疫者外周血出发制备预防或治疗性抗体,是研制突发传染病病原体中和抗体的有效手段;本研究筛选到的两个具有中和活性的抗汉坦病毒单抗,经过进一步的评价和优化,可能成为潜在的治疗HFRS的被动免疫制剂。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2016-05-10）
中和单抗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,我国发现的位于PRRSV 5亚群的PRRSV类NADC30株自2013年以来广泛流行。PRRSV的糖蛋白GP4在PRRSV感染以及产生中和抗体过程中发挥重要作用,但对于具有中和活性GP4 MAb的制备与研究却鲜有报道。本研究目的是制备具有中和活性的PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体(MAb)并鉴定出MAb识别的抗原表位,对了解PRRSV基因组的结构与功能,以及进一步利用中和单抗对PRRS进行免疫防治具有非常重要的意义。本研究用纯化的PRRSV SD53株病毒免疫6周龄的BALB/c雌鼠叁次,第叁次免疫7天后,经IFA检测结果显示小鼠血清全部转阳。取血清已经转为阳性的小鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合。经四次亚克隆,并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证,结果表明成功获得一株能够稳定分泌抗PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株,命名为LM26;对所获得的阳性杂交瘤细胞大量培养,并以这株细胞制备腹水,收集制备的腹水,经亲和层析纯化,western blot分析结果表明,已经获得了纯化后的MAb。IFA测定MAb LM26的细胞培养上清及腹水的效价为1:16和1:1600。该MAb对北美洲型PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最低为1:6,最高为1:50。该MAb亚型为IgG2a亚类,轻链为κ链。本研究进一步明确了LM26为抗PRRSV GP4单抗,并精确鉴定其识别的抗原表位。首先,将PRRSV SD53株一系列结构蛋白的核酸序列扩增后回收,利用两个核酸内切酶切开,并将回收后的片段连入到pGEX-6P-1表达的载体中,把一系列重组表达的质粒构建出来,利用这些质粒,进行重组蛋白的诱导和表达,获得了一系列表达的结构蛋白短肽与GST的融合蛋白。western blot结果显示,一系列重组蛋白均成功表达,且LM26仅与PRRSV重组表达后的GP4蛋白能够特异性的结合。其次,将测序正确后的质粒pCAGGS-FLAG-GP4瞬时转染到293T细胞作为检测抗原,用IFA验证已经成功表达的重组GP4蛋白与LM26反应,证明抗PRRSV GP4 MAb已经被成功的制备。最后,对该MAb识别GP4蛋白上抗原表位进行鉴定,western blot结果显示LM26识别GP4蛋白的aa 57~aa 62(~(57)VVLQDI~(62))。将序列~(57)VVLQDI~(62)与在GenBank中下载的28株国内外PRRSV株GP4氨基酸序列比对,结果显示,位于GP4蛋白的aa 57~aa 62这段序列,在HP-PRRSV株以及类NADC30 PRRSV株中呈现高度保守;在经典PRRSV株中存在2个突变位点,分别是V~(57)A和Q~(60)H;在欧洲PRRSV株中存在1个突变位点V~(57)M。然而,IFA检测结果显示,LM26与疫苗株HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92反应,与欧洲株DV、VP046BIS不反应,由此推测V~(57)A、Q~(60)H突变不影响LM26对抗原表位的识别,该表位在美洲型PRRSV中相对保守。综上所述,本研究成功制备出一株具有中和活性的抗PRRSV GP4蛋白MAb,并鉴定了其识别表位位于GP4蛋白~(57)VVLQDI~(62),该MAb有助于进一步研究PRRSV基因组的结构和功能。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
中和单抗论文参考文献
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标签：斑块状银屑病; IL-17F; Bimekizumab; 白细胞介素;