论文摘要
目的:构建ING4及PTEN腺病毒载体,研究其体内外抗肿瘤的效果和分子调控机理。方法:在已成功克隆了mING4的基础上,根据hING4氨基酸序列,将m ING4基因用点突变技术进行改造。设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING基因序列进行了人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列（简称ING4）.酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack-CMV上,形成重组载体pAdTrack-CMV-ING4。重组载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到的重组腺病毒载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-ING4经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad-ING4。同时,通过同样的方法获得了Ad-PTEN。用Ad-ING4和Ad-PTEN感染人肺癌细胞A549, MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4和Ad-PTEN对细胞生长抑制和诱导凋亡作用,侵袭小室检测Ad-ING4对A549肺癌细胞体外转移浸润的影响。RT-PCR、Western-blotting及ELISA分析Ad-ING4和Ad-PTEN的作用机理。在nu/nu裸鼠皮下建立A549人肺癌的动物模型,观察Ad-ING4和Ad-PTEN基因治疗肺癌的效果,并进一步研究其机理。MTT法检测Ad-ING4和Ad-PTEN对人脐静脉内皮细胞ECV304生长的影响,ELISA检测对ECV304细胞分泌血管内皮生长因子VEGF的影响。结果:成功获得人源化改造ING4和PTEN基因,序列测定结果与GenBank报道的完全一致。并成功构建了重组腺病毒Ad-ING4和Ad-PTEN,可显著抑制A549肺癌细胞生长,诱导细胞的凋亡。Ad-ING4明显影响A549肺癌细胞体外转移浸润。体内Ad-ING4和Ad-PTEN也能抑制A549肺癌细胞的生长。Ad-ING4在A549肺癌细胞中上调P21的表达,对P53的表达无明显影响,下调IL-6、IL-8和MMP2及MMP9的表达。另外在人肺癌组织中下调CD34的表达。Ad-PTEN在A549肺癌细胞中能下调IL-6、IL-8的表达。在人肺癌组织中下调CD34的表达。Ad-ING4和Ad-PTEN明显抑制ECV304内皮细胞增殖和下调VEGF的表达。结论:Ad-ING4和Ad-PTEN可在体内外抑制肺癌细胞的生长,诱导肺癌细胞
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