斑点叉尾鮰病毒（CCV）ORF6基因“自杀性”DNA疫苗的构建与免疫效果研究

论文摘要

本研究构建了斑点叉尾鮰传统DNA疫苗和“自杀性”DNA疫苗,鉴定检测了两者在细胞中的表达差异,并对两种疫苗的免疫效果进行了比较。1.斑点叉尾鮰病毒（Channel Catfish Virus, CCV）“自杀性”DNA疫苗的构建根据斑点叉尾鮰病毒（CCV） ORF6基因序列,设计合适的引物,扩增ORF6基因,分别将其克隆到“自杀性”DNA疫苗载体pSFV与常规DNA疫苗载体pcDNA3.1中,转化大肠杆菌DH5α后提取质粒,构建“自杀性”DNA疫苗ps-ORF6与常规DNA疫苗pcd-ORF6,利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行PCR扩增、提取质粒酶切以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。2. CCV ORF6基因在细胞中的表达将待验证的表达CCV ORF6基因的“自杀性”DNA疫苗和常规DNA疫苗重组质粒分别转染293T细胞（人胚肾细胞）,间接免疫荧光试验表明ORF6基因在细胞中均获得表达,但“自杀性”DNA疫苗表达载体的表达量显著低于常规DNA疫苗表达载体。3.CCV“自杀性”DNA疫苗对斑点叉尾鮰免疫指标的影响用构建的“自杀性”DNA疫苗ps-ORF6（Ⅲ组）与常规DNA疫苗pcd-ORF6（IV组）两种质粒制作的疫苗及对照的另外三种免疫剂（Ⅰ组为“自杀性”空载体pSFV制成、Ⅱ组为常规载体pcDNA3.1 （+）制成、Ⅴ组为缓冲液PBS）免疫80±10g的斑点叉尾鮰,分别在第0周、第2周、第4周、第6周、第8周等不同时间取血检测血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血液总蛋白含量等指标。实验结果与分析如下：（1）CCV“自杀性”DNA疫苗引起的白细胞吞噬活性较对照组有显著性差异（P<0.05）,均高于其它对照组。表明CCV“自杀性”DNA疫苗能够更好地增强鱼体白细胞吞噬活性,增强免疫力。本实验结果也表明,影响斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性的因素较多,实验各组都有所增强。（2）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清溶菌酶含量比Ⅴ组高,其中Ⅲ组和Ⅳ组显著高于其它组别（P<0.05）,同时,Ⅲ组显著高于Ⅳ组（P<0.05）。表明CCV“自杀性”DNA疫苗能够有效地提高斑点叉尾鮰血清溶菌酶含量。（3）各实验组均能引起斑点叉尾鮰血清蛋白含量的增加,但是从组间存在显著性差异来看,CCV“自杀性"DNA疫苗相对其它组没有明显的优势,其结果可能受到外界的影响与免疫试剂的影响有交叉共同作用。4.CCV“自杀性”DNA疫苗对生长的影响。统计免疫后各组斑点叉尾鮰的生长情况,发现各组生长情况良好,组间差异不显著,表明各组免疫剂对斑点叉尾鮰生长的影响不大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 斑点叉尾鮰病毒的基本特性及斑点叉尾鮰病毒性疾病的特点
• 2 鱼类核酸疫苗研究进展
• 2.1 疫苗种类
• 2.1.1 死疫苗
• 2.1.2 活疫苗
• 2.1.3 亚单位疫苗
• 2.1.4 基因工程疫苗
• 2.1.5 DNA疫苗
• 2.2 鱼类DNA疫苗的接种方式
• 2.2.1 注射免疫
• 2.2.2 口服免疫
• 2.2.3 浸泡免疫
• 2.3 鱼类疫苗免疫效果评价
• 2.3.1 鱼类的免疫基础
• 2.3.2 鱼类的免疫器官
• 2.3.3 鱼类的免疫细胞
• 2.3.4 鱼类的体液免疫因子
• 2.3.5 特异性免疫水平的检测
• 2.3.6 非特异性免疫水平的检测
• 2.3.7 免疫保护率（RPS）和免疫保护指数（PI）
• 2.4 鱼用疫苗的研究概况
• 3 鱼用疫苗发展存在的问题及其前景
• 3.1 鱼用疫苗的免疫效果
• 3.2 有效的接种方式
• 3.3 鱼用疫苗发展的前景
• 4 "自杀性"DNA疫苗国内外研究进展现状
• 5 目的与意义
• 第二章 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗表达质粒的构建及体外表达检测
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株和细胞
• 1.1.2 寡核苷酸引物
• 1.1.3 质粒与载体
• 1.1.4 主要药品及试剂
• 1.1.5 主要培养基、抗生素及溶液配制
• 1.1.6 主要仪器设备
• 1.1.7 主要耗材
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 CCV ORF6的扩增
• 1.2.2 PCR产物的检测与回收
• 1.2.3 CCV ORF6与质粒的酶切、回收
• 1.2.4 载体去磷酸化
• 1.2.5 目的基因与载体的连接
• 1.2.6 转化
• 1.2.7 挑菌鉴定
• 1.2.8 质粒的大量提取（无内毒素质粒大提试剂盒）
• 1.2.9 脂质体介导转化法（Lipfectin2000,Invitrogen Corp.）
• 1.2.10 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白在细胞中表达
• 2 结果与分析
• 2.1 CCV ORF6的扩增
• 2.2 菌体PCR鉴定重组质粒
• 2.3 ps-ORF6构建的进一步鉴定
• 2.4 测序
• 2.5 间接免疫荧光检测重组质粒真核细胞中的表达
• 3 讨论
• 第三章 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗免疫效果研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料与主要仪器
• 1.1.1 疫苗与斑点叉尾鮰病毒（CCV）
• 1.1.2 实验鱼
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 斑点叉尾鮰疫苗的安全性检验
• 1.3 免疫方案
• 1.3.1 分组
• 1.3.2 免疫和采血
• 1.4 免疫指标的测定
• 1.4.1 血液白细胞吞噬活性的测定
• 1.4.2 血清溶菌酶含量的测定
• 1.4.3 血清总蛋白含量的测定
• 1.5 抗血清中和效价测定
• 1.6 统计学分析
• 2 实验结果与分析
• 2.1 白细胞吞噬活性测定
• 2.2 血清溶菌酶含量测定
• 2.3 血清蛋白含量测定
• 2.4 抗血清中和效价测定
• 2.5 试验鱼生长状况
• 3 讨论
• 3.1 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗对斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性的影响
• 3.2 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗对斑点叉尾鮰血清溶菌酶含量的影响
• 3.3 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗对斑点叉尾鮰血清蛋白含量的影响
• 3.4 斑点叉尾鮰病毒（CCV）"自杀性"DNA疫苗对斑点叉尾鮰生长的影响
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历