绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其在鱼糜加工和对虾保鲜中的应用

论文摘要

本研究以绿豆为原料，通过硫酸抽提、加热处理、超滤浓缩，DEAE-Sepharose阴离子交换柱、Superdex75凝胶过滤等方法，纯化得到绿豆胰蛋白酶抑制剂（Mung bean trypsininhibitor, MBTI）。SDS-PAGE显示其分子量约为9ku, MALTI-QIT-TOF MS质谱分析得到其分子量为8887.25u。性质分析表明MBTI对鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（Myofibril-bound Serine Proteinase, MBSP）和猪胰蛋白酶有明显的抑制作用，其活力为3812U/mL。MBTI对MBSP的抑制机理为竞争性抑制，MBTI对由MBSP所引起的鱼类肌原纤维蛋白质分解具有显著的抑制作用，推测其对鱼糜制品凝胶形成能力、弹性及品质也有改善效果。针对我国南美白对虾产量大、虾死后肌肉易降解等品质保藏实际问题，通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose，Phenyl-Sepharose，Hydroxyapatite，Superdex-75等方法从南美白对虾消化腺中分离得到一种丝氨酸蛋白酶。SDS-PAGE结果显示其分子量约为28ku左右，最适pH与最适温度分别为9.0和40℃，该酶在35℃以下以及pH7.0-10.0之间有较高的稳定性。利用Edman降解法测定了该酶的N末端氨基酸序列为IVGGTDAKPGELPYQLSFQDI，与报道的丝氨酸蛋白酶有高度同源性。底物特异性实验与抑制剂实验结果进一步表明该酶属于类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶。动力学实验显示，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物时，Km=0.69nmol/L，kcat=0.33S-1，kcat/Km=5×10（8mol/L）-1S-1。本研究发现，MBTI对南美白对虾肌肉的自身降解有明显的抑制效果，可作为对虾保鲜剂的重要成分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要中英文对照
• 第1章 引言
• 1.1 绿豆胰蛋白酶抑制剂
• 1.2 南美白对虾
• 1.3 研究内容与实施方案
• 1.3.1 主要要研究内容
• 1.3.2 实施方案
• 1.4 MBTI 在水产加工中的应用
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.2 试剂
• 2.2.1 层析树脂
• 2.2.2 荧光底物
• 2.2.3 蛋白酶抑制剂
• 2.2.4 SDS-PAGE 所用试剂
• 2.2.5 Western Blot 所用试剂
• 2.3 实验所用溶液及其配制
• 2.3.1 SDS-PAGE 所用溶液
• 2.3.2 银染色所用溶液
• 2.3.3 Western Blot 所用溶液
• 2.3.4 酶活性测定终止液
• 2.3.5 各种 pH 缓冲液
• 2.4 仪器和设备
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 蛋白质含量的测定
• 2.5.2 丝氨酸蛋白酶活力测定
• 2.5.3 SDS-PAGE,银染色和 Western Blot 检测
• 2.5.4 绿豆胰蛋白酶抑制剂（MBTI）的研究
• 2.5.5. 鲢及南美白对虾丝氨酸蛋白酶研究
• 2.5.6 酶的性质分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 MBTI 的结果分析
• 3.1.1 MBTI 的纯化结果
• 3.1.2 MBTI 的抑制类型鉴定
• 3.1.3 MBTI 对 MBSP 引起的鲢肌原纤维降解的影响
• 3.1.4 MBTI 对肌原纤维中其他结构蛋白分解的影响
• 3.1.4.1 MBTI 对原肌球蛋白分解的影响
• 3.1.4.2 MBTI 对肌动蛋白分解的影响
• 3.1.4.3 MBTI 对肌丝蛋白（desmin）分解的影响
• 3.2 虾头中丝氨酸蛋白酶的分离纯化
• 3.2.1 丝氨酸蛋白酶的柱层析分离
• 3.2.2 丝氨酸蛋白酶的纯化结果
• 3.3 南美白对虾丝氨酸蛋白酶的性质研究
• 3.3.1 电泳
• 3.3.2 酶的底物特异性
• 3.3.3 蛋白酶抑制剂对酶活的作用
• 3.3.4 金属离子对酶活性的影响
• 3.3.5 酶的最适温度和温度稳定性
• 3.3.6 酶的最适 pH 和 pH 稳定性
• 3.3.7 盐浓度对酶活性的影响
• 3.3.8 酶的动力学参数确定
• 3.4 绿豆胰蛋白酶抑制剂在对虾保鲜中的应用
• 3.4.1 对虾肌肉蛋白的组成分析
• 3.4.2 MBTI 对对虾肌浆蛋白分解的抑制作用
• 3.4.3 MBTI 对对虾肌原纤维蛋白分解的抑制作用
• 第4章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文