癌细胞中端粒酶的活性的光电化学传感分析

论文摘要

针对恶性肿瘤等疾病早期检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性尚需提高的问题,本文将纳米金的放大技术、磁珠的磁性分离技术、核酸分子杂交技术和生物条码技术相结合,研制了操作简单、高灵敏度和高特异性的生物传感器,实现了对癌细胞中端粒酶活性的检测。本文主要从以下两个方面进行研究和概述:1构建一种基于生物条码放大技术进行高灵敏度检测端粒酶活性的电致化学发光生物传感器。从海拉细胞中提取的端粒酶与其扩展前体作用进行端粒酶的扩展反应,反应产物跟固定在电极上的捕获DNA和DNA-纳米金复合物上的信号DNA杂交,形成“三明治”结构的复合物,DNA-纳米金复合物上的条码DNA再与其互补连杂交。修饰好的电极浸入含[Ru（phen）2dppz]2+的缓冲溶液中,[Ru（phen）2dppz]2+通过嵌插作用跟DNA-纳米金复合物上的双链DNA结合,通过产生的电致化学发光信号对端粒酶活性进行检测,这种方法不需要PCR扩增就可以检测到1000个HeLa细胞中提取的端粒酶。2研制了基于端粒扩展形成的DNA酶增强化学发光检测端粒酶活性的化学发光分析法。这种方法是从海拉细胞中提取的端粒酶跟其扩展前体混合进行端粒扩展反应,由于端粒酶的特异性在端粒末端合成TTAGGG重复序列,反应产物跟固定在磁珠上的捕获DNA杂交,在K+的存在下,TTAGGG重复序列能够形成特殊的G-四分体的结构,这种特殊结构能够将hemin稳定的结合在里面形成一种过氧化物模拟酶,这种酶能够有效的增强luminol-H2O2化学发光体系的发光信号,从而提高对端粒酶活性检测的灵敏度。这种方法也克服了以前检测端粒酶方法的缺点,为癌症的早期诊断提供了一种可行的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 化学发光分析法
• 1.1 化学发光概述
• 1.2 化学发光基本原理
• 1.3 常见的化学发光反应体系
• 1.3.1 鲁米诺及其衍生物类化学发光反应体系
• 1.3.2 过氧草酸酯类化学发光反应体系
• 1.3.3 吖啶酯化合物化学发光反应体系
• 1.3.4 联吡啶钌配合物类化学发光反应体系
• 1.3.5 酸性高锰酸钾化学发光反应体系
• 2 生物传感器
• 2.1 生物传感器的原理与分类
• 2.2 DNA 生物传感器简介
• 2.3 DNA 生物传感器的设计
• 2.3.1 单链DNA 在电极表面的固定化
• 2.3.2 DNA 杂交的信号转换
• 2.4 DNA 生物传感器的在医学领域的应用
• 2.4.1 临床医学
• 2.4.2 军事医学
• 2.5 DNA 生物传感器的研究现状和发展趋势
• 3 纳米材料
• 3.1 纳米材料的性能
• 3.1.1 小尺寸效应
• 3.1.2 表面效应
• 3.1.3 量子尺寸效应
• 3.1.4 宏观量子隧道效应
• 3.1.5 催化性质
• 3.2 纳米电化学DNA 生物传感器的研究进展
• 3.2.1 固定化载体
• 3.2.2 信号粒子
• 4 课题意义及主要内容
• 参考文献
• 2dppz]²⁺电致化学发光及生物条码放大检测端粒酶活性'>第二章 基于[Ru（phen）₂dppz]²⁺电致化学发光及生物条码放大检测端粒酶活性
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2dppz] （PF₆）₂·5H₂0 的合成'>2.2.1 [Ru（phen）₂dppz] （PF₆）₂·5H₂0 的合成
• 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取
• 2.2.3 金纳米粒子的制备
• 2.2.4 DNA-金纳米粒子复合物的制备
• 2.2.5 端粒酶扩展反应
• 2.2.6 传感器的组装
• 2.2.7 电致化学发光测量
• 3 结果与讨论
• 3.1 用于检测端粒酶活性的传感器设计方案及工作原理
• 3.2 实验条件的优化
• 3.2.1 增强剂TPA 浓度的选择实验
• 2dppz]²⁺嵌插时间的优化'>3.2.2 [Ru（phen）₂dppz]²⁺嵌插时间的优化
• 3.2.3 缓冲溶液pH 的选择
• 3.2.4 DNA-金纳米粒子复合物中信号DNA 与条码DNA 比例的优化
• 3.2.5 端粒酶扩展时间的优化
• 3.2.6 端粒酶扩展温度的优化
• 3.3 端粒前体标准DNA 链灵敏度检测实验
• 3.4 海拉细胞中端粒酶活性的测定
• 3.5 选择性实验
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 基于端粒扩展形成的 DNA 酶化学发光检测端粒酶的活性
• 1 引言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器装置
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 金纳米粒子的制备；细胞培养和端粒酶提取；端粒酶扩展反应
• 2.2.2 纳米金功能化磁珠（MB-Au NPs）的制备
• 2.2.3 DNA-金纳米粒子复合物的制备
• 2.2.4 过氧化物模拟酶的制备与传感器的组装
• 2.2.5 化学发光检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 实验原理
• 3.2 巯基修饰的磁珠包被纳米金颗粒前后的 TEM 表征
• 3.3 可行性实验
• 3.4 实验条件优化
• 3.4.1 不同进样方式对化学发光强度的影响
• 3.4.2 鲁米诺浓度的影响
• 20₂ 浓度的影响'>3.4.3 H₂0₂浓度的影响
• 3.4.4 缓冲溶液pH 值对化学发光强度的影响
• 3.4.5 端粒酶扩展反应时间与温度的优化
• 3.5 控制实验
• 3.6 海拉细胞中的端粒酶活性的测定
• 4 小结
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文目录