口蹄疫非结构蛋白3ABC单克隆抗体的制备及初步应用

论文摘要

口蹄疫（FMD）是严重影响畜牧业的世界性烈性传染病，除大洋洲、北美洲之外，世界各地皆有流行。国际兽医局（OIE）和联合国粮农组织（FAO）将口蹄疫列为A类烈性传染病之首。我国也将其列为一类动物传染病之首。口蹄疫在发达国家或地区往往通过捕杀感染动物及同居动物、可疑畜群来控制和消灭本病，而发展中国家多采用注射疫苗的方法控制该病的流行。因此在使用疫苗的情况下，如何区分野毒感染动物和注苗动物是控制和消灭该病的关键，建立有效的鉴别诊断方法是口蹄疫防制技术的重要课题，也是国际兽医局（OIE）判定一个国家或地区有无口蹄疫的依据，因此具有十分重要的意义。目前，许多文献的研究都证明检测FMDV非结构蛋白（NSP）抗体可以区分免疫和感染动物。在单个NS蛋白中多聚蛋白3ABC抗体是检测FMD感染的最可靠单一指示器。不管动物是否接种过疫苗，NS蛋白3ABC抗体的检测（通常与其它NSP中的一种或一种以上的抗体联合）是确定是否感染FMDV的证据。以畜群整体而言，检测3ABC抗体能够监测注射疫苗畜群中的感染情况。常规的间接ELISA方法由于采用大肠杆菌的融合表达蛋白，含有痕量的大肠杆菌蛋白，在临床上常会产生假阳性的结果，本研究制备了3ABC蛋白的单克隆抗体，建立了针对FMDV的非结构蛋白3ABC的单抗捕获ELISA和竞争ELISA方法。经临床试验证明，这两种方法均具有较高的敏感性和特异性，可以用于临床检测。具体研究情况如下：1．口蹄疫3ABC蛋白单克隆抗体的制备以纯化的3ABC蛋白为免疫原，免疫Balb／C小鼠，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合，用间接ELISA方法筛选，采用有限稀释法对其进行克隆，经过3次融合共获得3株能稳定分泌抗3ABC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D1，1E2，2E3。三株单抗的腹水效价分别为211×100，211×100，210×100。所有单抗特异性良好，与载体蛋白无交叉反应。2．单抗捕获ELISA的建立和初步应用以单抗1D1包被酶标板，再加入粗提的3ABC蛋白，通过单抗捕获3ABC蛋白，建立了3ABC单抗捕获ELISA方法。用方阵滴定确定单抗浓度为1∶2000，蛋白最佳浓度是2.1μg／ml，最佳血清稀释倍数为1∶400，通过测定160份FMDV阴性血清，确定了该方法的阳性判定标准。特异性、重复性及临床试验结果表明，该方法特异性强、重复性好。与国外同类试剂盒的比较试验，共检测血清184份，两者均检测为阳性14份，均检测为阴性165份，符合率97.28％；与国内同类试剂盒的比较试验，共检测血清168份，两者均检测为阳性3份，均检测为阴性159份，符合率95.83％。3．竞争ELISA的建立和初步应用以3ABC蛋白为抗原，以酶标单抗1D1为第二抗体，建立了检测FMD非结构蛋白3ABC抗体竞争ELISA方法，对于影响ELISA反应条件的各种因素进行了优化和选择。用方阵滴定确定蛋白包被浓度为2.1μg／ml，酶标单抗的浓度为1∶3200，通过检测160份阴性血清，20份阳性血清，确定血清抑制率大于60判定为阳性。特异性、重复性及临床试验结果表明，该方法特异性强、重复性好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 口蹄疫及其危害
• 1.2 口蹄疫的分布与流行
• 1.3 口蹄疫病毒
• 1.3.1 口蹄疫并毒的形态特征
• 1.3.2 口蹄疫病毒的抗原性与变异性
• 1.3.3 口蹄疫病毒分子生物学研究进展
• 1.4 口蹄疫流行病学特征
• 1.4.1 易感动物
• 1.4.2 传染源与 FMDV持续性感染
• 1.5 口蹄疫的防制
• 1.6 口蹄疫诊断技术研究进展
• 1.6.1 病原学诊断
• 1.6.2 抗体检测
• 1.6.3 鉴别诊断
• 1.7 单克隆抗体在口蹄疫病毒研究中的应用
• 1.7.1 单抗在FMDV中和抗原的分析与定位中的应用
• 1.7.2 单抗在口蹄疫诊断和检疫中的应用
• 第2章 研究的目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白的表达
• 3.2.2 表达蛋白的鉴定
• 3.2.3 表达蛋白的提取、变性与复性
• 3.2.4 单抗的制备
• 3.2.5 单克隆抗体的鉴定
• 3.2.6 单克隆抗体腹水的纯化
• 3.2.7 酶标单克隆抗体的制备
• 3.2.8 单抗捕获ELISA方法的建立
• 3.2.9 竞争ELISA方法的建立
• 第4章 结果与分析
• 4.1 原核表达载体的鉴定
• 4.2 融合蛋白的提取
• 4.3 3ABC间接ELISA方法的确定
• 4.4 单抗的制备
• 4.4.1 融合后筛选及克隆化培养结果
• 4.4.2 细胞融合后结果观察
• 4.4.3 染色体计数结果
• 4.4.4 单抗亚类鉴定结果
• 4.4.5 单抗效价测定
• 4.4.6 单克隆抗体抗原表位的鉴定结果
• 4.4.7 稳定性检测
• 4.4.8 单抗 1D1的提纯
• 4.5 捕获 ELISA的建立
• 4.5.1 蛋白包被浓度和单抗浓度的确定
• 4.5.2 封闭液的选择
• 4.5.3 血清稀释度的选择
• 4.5.4 血清温育时间的选择
• 4.5.5 血清稀释液的选择
• 4.5.6 酶标二抗温育时间的选择
• 4.5.7 阴阳性界限的确定
• 4.5.8 特异性实验
• 4.5.9 敏感性实验
• 4.5.10 重复实验
• 4.5.11 临床实验
• 4.6 竞争 ELISA方法的建立
• 4.6.1 酶标单抗效价测定
• 4.6.2 3ABC蛋白包被浓度与酶标单抗浓度的确定
• 4.6.3 封闭液的选择
• 4.6.4 血清稀释液的选择
• 4.6.5 血清稀释度的选择
• 4.6.6 血清温育时间的选择
• 4.6.7 酶标单抗温育时间的选择
• 4.6.8 阴阳界线的确定
• 4.6.9 特异性试验
• 4.6.10 敏感性实验
• 4.6.11 重复性实验
• 4.6.12 临床实验
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢