围胸总目、短尾次目（甲壳动物亚门）DNA条形码研究

论文摘要

分类学是生物学研究的基础，但发展相对较慢，上世纪80年代之前，分类学界主要还是依据物种的形态特征进行分类，但是由于趋同进化，趋异进化，幼体形态难以捕捉，自然因素导致的形态标准难以描述等因素，给基于形态特征的分类学带来了弊端。80年代之后,分子分类学飞速发展，2000年，DNA分类应用而生，近十几年,已有各个领域的学者对DNA分类展开探索，取得了喜人的成果。Heber的分类阈值，即种内小于2%，种间大于10%也为分子分类学界认可。甲壳类动物多样性极高，而且包括很多的经济类动物，比如虾蟹等等；还包括一些污损生物，比如藤壶类。本文的研究将使甲壳类系统分类更加完善，为甲壳类DNA条形码数据库提供数据支持，且给一些地区和人员带来更大的经济效益。本文共采集甲壳动物标本89个，其中包括藤壶总目48个，短尾次目41个，经中科院海洋研究所专家任先秋研究员、蒋维博士形态鉴定后，全部存于中国科学院海洋生物标本馆。本文主要工作分两部分：（1）围胸总目隶属于甲壳纲鞘甲下纲，是甲壳纲中最低等的物种，它们生活在潮间带，外形奇特，曾一度被认为属于双壳类，物种之间常常由于海水泥沙的冲刷，形态不可辨认。本文利用DNA分子作为分类手段测定了藤壶科3亚科的多个代表种的线粒体基因COI，16S和12S的部分序列，结合GenBank中藤壶科其它物种的12S，28S和18S等基因序列，比较了不同基因片段作为鉴别藤壶科物种的条形码的可行性和有效性，并联合16S和12S序列初步分析了藤壶科各亚科之间的一些亲缘关系。研究结果表明：COI基因的种间和种内遗传距离有明显的间隔区，COI最小种间距离为0.122，远大于最大种内距离0.023，而16S基因的种间与种内距离存在覆盖，最小种间距离为0.018，小于最大种内距离0.023，因此表明了，线粒体基因COI能更准确地鉴定藤壶科种间以及种内关系，并得出阈值为种内差异小于0.023，种间差异大于0.1。同时ML和BI系统发育分析结果基本一致，支持4亚科的分类系统；巨藤壶亚科形成明显单系群，支持率很高，而两种纹藤壶和管藤壶聚成一枝，形成一个单系，本结果支持Newman & Ross(1976)的假说，即纹藤壶属和管藤壶属应合并。（2）短尾次目隶属于甲壳纲十足目，是甲壳纲中最高等的物种，生活在潮间带，短尾次目是甲壳类系统发育上最进化，多样性最高的类群，个体形态常常发生趋同进化、趋异进化，使其系统发育关系到目前仍然是错综复杂，基于形态特征的分类工作难以进行，本文利用DNA信息作为分类手段测定了短尾次目5总科的代表物种的线粒体COI基因的部分序列，初步分析了短尾次目各科之间的一些亲缘关系，结果表明，BI树，NJ树，MP树结果基本一致显示5总科的分类系统与现行的形态学分类系统一致；除了几个个别物种，短尾类属内种间的遗传距离最小10.1%，大于10%，而种内遗传距离最大1.2%，小于2%，且种间与种内的遗传差异形成一个明显间隔，证明了DNA分类同样适用于甲壳纲中多样性较高的类群，同时也表明Hebert关于DNA条形码分类的阈值同样适用于甲壳纲短尾类；根据种内种间遗传距离的计算和系统树的构建发现三斑强蟹Eucrate tripunctata Campbell种内存在隐存种。来自海南临高的标本与来自广西的标本聚在一枝，而来自广西的另外4个标本聚为一枝，两枝均有较高支持率，且两枝物种之间的遗传差异高达8.9%，而每枝的姐妹种之间的遗传差异只有0，而海南临高海域与广西北海海域均属于同一海域区系北部湾区系，排除了趋异进化的可能，即本结果揭示出三斑强蟹种内存有隐存种；基于COI基因构建系统发育树，MP、NJ、BI三棵树均显示相手蟹科物种双齿近相手蟹Perisesarma bidens与方蟹总科中的侧足厚蟹聚为一枝，且遗传距离为0.133，而与沙蟹总科的相关物种的遗传距离均大于0.2，双齿近相手蟹与方蟹总科的亲缘关系较之沙蟹总科更近，故本文支持Martin和Davis(2001)和Ng(2008)将相手蟹科归于方蟹总科下的观点；而BI树和NJ树中显示，浓毛拟闭口蟹Paracleistostoma crassipilum与方蟹总科的物种聚为一枝，与沙蟹总科中其他类群的平均遗传距离均大于与方蟹总科中其他类群的平均遗传距离，支持毛开云（2010）的观点，即认为该种属于方蟹科和尚蟹属的短指和尚蟹Mixtyris brevidactylus在BI树中与方蟹总科的各类群聚在一起，置信度达到0.80，而在平均遗传距离的分析中，和尚蟹科与方蟹总科和沙蟹总科的遗传差异相当，而三棵树中只有BI树支持和尚蟹归属于方蟹总科，其余两棵树均显示和尚蟹自成单系，想要彻底搞清楚和尚蟹科到底应该归属于方蟹总科还是沙蟹总科还需要大量的扩大标本进行试验论证，本文的结果支持吉诺特Guinot，1978的分类系统，即将和尚蟹科提升为总科，并列与沙蟹总科和方蟹总科。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 甲壳动物概述
• 1.1.1 围胸总目生物学特性以及分类地位
• 1.1.2 短尾次目生物学特性以及分类地位
• 1.2 分子系统学概述
• 1.2.1 常用分子标记（molecularmarker）技术
• 1.2.2 分子系统树构建
• 1.3 DNA 分类和 DNA 条形码
• 1.3.1 DNA 分类
• 1.3.2 DNA 条形码
• 1.3.3 DNA 分类和 DNA 条形码的关系
• 1.4 甲壳动物的分子系统学及研究进展
• 1.5 本论文研究目的和意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料和来源
• 2.2 实验仪器和实验试剂
• 2.2.1 实验仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 DNA 提取与检测
• 2.3.2 PCR 扩增及克隆
• 2.3.3 PCR 产物测序
• 2.4 数据处理
• 2.4.1 序列特征分析
• 2.4.2 遗传距离及系统发育分析
• 3 甲壳类 DNA 条形码研究
• 3.1 基于藤壶科验证筛选 DNA 条形码分子标记
• 3.1.1 基于 5 种 barcoding 序列特征分析
• 3.1.2 碱基组成
• 3.1.3 藤壶科物种种间及种内的遗传距离
• 3.2 围胸总目 DNA 条形码研究
• 3.2.1 围胸总目 COI 条形码序列特征分析
• 3.2.2 围胸总目 COI 条形码序列遗传距离分析
• 3.2.3 围胸总目系统发育的初步分析
• 3.3 短尾次目 DNA 条形码研究
• 3.3.1 短尾次目 COI 条形码序列特征分析
• 3.3.2 短尾次目 COI 条形码序列遗传距离分析
• 3.3.3 几个争议种
• 3.3.4 短尾次目系统发育初步分析
• 3.4 COI 基因作为 DNA 条形码在甲壳动物鉴定中的有效性分析
• 3.5 DNA 条形码序列用于甲壳动物的系统发育的可行性分析
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间论文发表情况