高多糖的姬松茸和灰树花品种及其生物活性的研究

高多糖的姬松茸和灰树花品种及其生物活性的研究

论文摘要

收集了全国26份姬松茸和29份灰树花茵种,筛选出高多糖的姬松茸和灰树花品种,并研究其多糖的生物活性,主要结果如下:1.通过RAPD、SRAP、ISSR分子标记和ITS序列扩增对26(A01~A26)份姬松茸菌种过行多态性分析,综合四种分子标记的结果,采用类平均法(UPGMA)进行聚类分析,姬松茸可分为4大类.其中第2类的A08和A10茵种间的相异系数为0;第3类的A15、A16、A17菌种间的相异系数为0;第4类的A20、A21、A22菌种间的相异系数为0;这些菌种是同种异名,为同一个栽培种.通过RAPD、SRAP和ISSR的综合聚类分析,29份灰树花菌种(G01~G29)可分为8大类.其中第3类的G15与G16菌种间的相异系数为0;第8类的G07和G10菌种间的相异系数为0;第8类的G14、G18、G21、G26、G27菌种间的相异系数为0;这些菌种是同种异名,为同一个栽培种.2.采用正交法,对热水浸提法,超声辅助热水浸提法及微波辅助热水漫提法的姬松茸、灰树花多糖提取工艺进行了优化.姬松茸多糖热水浸提法的最佳工艺为:pH值7.5,料水比为1∶20,提取温度为100℃,提取时间为4 h,醇沉浓度为100%,多糖提取率为12.17%,多糖含量为64.84%.超声辅助热水浸提法的最佳条件为:超声功率600W,超声时间4min,漫提时间2h,多糖提取率为13.76%,多糖含量为54.97%;应用超声波可提高姬松茸多糖提取率13.06%,但是多糖含量下降了9.87%.微波辅助热水浸提法的最佳条件为:中功率,微波时间4min,水提2h,多糖提取率为14.13%,多糖含量为66.29%;应用微波可提高姬松茸多糖提取率16.10%,对多糖含量没有显著影响.灰树花多糖热水浸提法的最佳工艺为:pH值7.5,料水比为1∶20,提取温度为100℃,提取时间为4 h,醇沉浓度为95%,多糖提取率为7.08%,多糖含量为73.49%.超声辅助热水浸提法的最佳条件为:超声功率400W,超声时间6min,浸提时间2h,多糖提取率为8.04%,多糖含量为58.60%;应用超声波可提高灰树花多糖提取率13.56%。但与热水浸提法相比,多糖含量下降了14.89%.微波辅助热水浸提法的最佳条件为:高功率,微波时间4min,水提2h,多糖提取率为9.17%,多糖含量为70.41%,应用微波可提高灰树花多糖提取率29.52%,对多糖含量没有显著影响.3.对4类姬松茸品种和8类灰树花品种的多糖进行提取测定.筛选出高多糖姬松茸品种“AB01”,其发酵胶多糖含量达2.05mg/ml,是应用面积最广品种“N-2”(1.44mg/ml)的1.42倍,是平均值(1.27mg/ml)的1.61倍,是多糖含量最低品种“AB03”(0.61mg/ml)的3.36倍.该品种的深层发酵产量高,胞内多糖含量为12.04%,胞外多糖含量为1.54mg/ml.筛选出高多糖灰树花品种“GF06”,其发酵胶多糖含量达1.65mg/ml,是应用面积最广品种“52”(0.65mg/ml)的2.53倍,是平均值(0.59mg/ml)的2.79倍,是多糖含量最低品种“GF03”(0.22mg/ml)的7.50倍.该品种胞内多糖含量为7.22%,胞外多糖含量为0.98 mg/ml.4.通过构建小鼠S180荷瘤模型对姬松茸和灰树花及复合多糖组分进行抗肿瘤作用研究.姬松茸组中:“AB01”的发酵胶多糖(AB01-P)对小鼠S180肿瘤有极显著的抑制活性,与剂量呈正相关,高剂量组的抑瘤率为45.36%;高于“AB03”的发酵胶多糖(AB03-P)的最佳抑瘤率(25.14%)、“AB01”的胞内多糖(AB01-P-1)的最佳抑瘤率(36.61%)、“AB01”的胞外多糖(AB01-P-2)的最佳抑瘤率(30.05%).灰树花组中:“GF06”的发酵胶多糖(GF06-P)有极显著的抑制S180肿瘤活性,与剂量呈正相关,高剂量组的抑瘤率为42.08%;高于“GF03”的发酵胶多糖(GF03-P)的最佳抑瘤率(26.78%)、“GF06”的胞内多糖(GF06-P-1)的最佳抑瘤率(38.25%)、“GF06”的胞外多糖(GF06-P-2)的最佳抑瘤率(39.89%).“AB01”和“GF06”发酵胶复合多糖(AG-P)低、中剂量组的抑瘤率呈剂量效应,高剂量组的抑瘤率较中剂量组没有提高,中剂量组的抑瘤率为49.18%.结果表明复合多糖组的抑瘤率较单个菌种多糖给药组略有提高.与对照组相比,姬松茸、灰树花及复合多糖各组分均可显著或极显著地提高S180荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数(免疫指标).5.采用Annexin V/PI双染色流式细胞仪研究了高多糖姬松茸品种“AB01”发酵胶多糖(AB01-P)、高多糖灰树花品种“GF06”发酵胶多糖(GF06-P)和复合多糖(AG-P)对人骨肉瘤细胞株(MG-63)早期凋亡的影响.结果表明AB01-P可诱导MG-63细胞凋亡,且具有量效关系,2.0mg/ml剂量组的凋亡率为30.98%;GF06-P对MG-63细胞凋亡没有明显作用.AG-P对MG-63细胞有一定的凋亡作用,凋亡率为16.35%,不具剂量效应.6.应用RT-PCR技术,研究了AB01-P和GF06-P对人脐血粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因表达的影响。AB01-P有诱导人脐血单个核细胞表达GM-CSF的作用,最佳浓度为2.0μg/ml,从而证实了姬松茸多糖促进粒-巨噬细胞生成和调节动物机体免疫功能的分子机理.GF06-P对人脐血单个核细胞GM-CSF基因表达的诱导作用不明显.7.通过果蝇生存试验计数果蝇半数死亡天数、平均寿命、最高平均寿命;测定果蝇组织匀浆中的SOD(超氧化物歧化酶)值、MDA(丙二醛)含量和总抗氧化能力值.姬松茸组中:AB01-P对果蝇平均寿命的延长率最高,与对照组相比,对雄果蝇寿命的延长率达17.32%,对雌果蝇的寿命延长率为11.40%;对果蝇半数死亡的延长率为10.81%(雄),10.21%(雌);对果蝇平均最高寿命的延长率为15.91%(雄),13.11%(雌).灰树花组中:GF06-P能显著延长雌果蝇的平均寿命,延长率为为22.00%,对雄果蝇寿命的延长率为17.67%;对果蝇半数死亡的延长率为13.31%(雄),19.71%(雌);对果蝇平均最高寿命的延长率为12.74%(雄),28.32%(雌).复合多糖AG-P对雄果蝇的寿命延长率达23.78%;对雌果蝇寿命延长率为13.06%;显著延长雄果蝇平均最高寿命,延长率为20.77%,对雌果蝇平均最高寿命的延长率为19.01%.AB01-P能极显著提高雄果蝇的总抗氧化能力,提高率为28.89%,对雌果蝇没有影响.AB01-P-2能极显著提高雄性果蝇的SOD值,提高率为42.77%,但对雌果蝇没有影响;极显著提高雄雌果蝇的总抗氧化能力,提高率分别为68.89%、40.54%.GF06-P能显著提高雄果蝇的总抗氧化能力,提高率为17.78%;极显著提高雌果蝇的总抗氧化能力,提高率为48.64%.GF06-P-1可以显著降低雌性果蝇的MDA含量,极显著降低雄性果蝇的MDA含量;显著提高雌果蝇的总抗氧化能力,提高率为18.92%。GF06-P-2可以显著提高雄果蝇的SOD值,提高率为12.26%;极显著提高雌果蝇SOD值,提高率为38.41%.复合多糖(AG-P)可以显著降低雌性果蝇的MDA值,但对雄性果蝇没有显著影响.

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 第一节 姬松茸研究进展
  • 1 姬松茸的营养价值
  • 2 姬松茸的深层发酵培养
  • 3 姬松茸多糖的分离纯化及结构分析
  • 4 姬松茸的药理和药用价值
  • 5 姬松茸多糖的研究展望
  • 第二节 灰树花研究进展
  • 1 灰树花的营养价值
  • 2 灰树花的深层发酵培养
  • 3 灰树花多糖的分离纯化及组分分析
  • 4 灰树花多糖的生物活性
  • 5 研究展望
  • 第三节 分子标记及其在食用菌研究中的应用
  • 1 应用于食用菌研究的分子标记
  • 2 分子标记在食用菌研究中的应用
  • 第四节 本项目研究目的及意义
  • 第二章 姬松茸和灰树花的种质资源分子标记鉴定
  • 第一节 姬松茸的分子标记鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试菌株
  • 1.2 培养基的配制
  • 1.3 主要试剂和仪器
  • 1.4 菌丝培养
  • 1.5 DNA提取方法
  • 1.6 PCR体系的建立
  • 1.7 PCR产物检测
  • 1.8 数据分析
  • 2 结果与分析
  • 2.1 RAPD结果分析
  • 2.2 ISSR结果分析
  • 2.3 SRAP结果分析
  • 2.4 RAPD、ISSR、SRAP综合分析
  • 2.5 ITS结果分析
  • 3 讨论
  • 第二节 灰树花的分子标记鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试菌株
  • 1.2 培养基的配制
  • 1.3 主要试剂和仪器
  • 1.4 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 RAPD结果分析
  • 2.2 ISSR结果分析
  • 2.3 SRAP结果分析
  • 2.4 RAPD、ISSR、SRAP综合分析
  • 3 讨论
  • 第三章 高多糖姬松茸和灰树花的品种筛选
  • 第一节 姬松茸多糖提取条件的优化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 热水浸提法最佳工艺的确定
  • 2.2 超声波对姬松茸多糖提取率的影响
  • 2.3 微波对姬松茸多糖提取率的影响
  • 2.4 三种提取方法结果比较
  • 3 讨论
  • 第二节 灰树花多糖提取条件的优化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 传统水提法最佳工艺的确定
  • 2.2 超声波对灰树花多糖提取率的影响
  • 2.3 微波对灰树花多糖提取率的影响
  • 2.4 三种提取方法结果比较
  • 3 讨论
  • 第三节 高多糖姬松茸和灰树花品种筛选
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 姬松茸与灰树花菌丝生长速度及生物量观测
  • 2.2 姬松茸不同菌种多糖含量测定
  • 2.3 灰树花不同菌种多糖含量测定
  • 3 讨论
  • 第四章 姬松茸、灰树花多糖的生物活性研究
  • 第一节 姬松茸、灰树花多糖的体内抗肿瘤作用研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 姬松茸、灰树花多糖的抗肿瘤活性
  • 180肿瘤小鼠免疫器官的影响'>2.2 姬松茸、灰树花多糖对S180肿瘤小鼠免疫器官的影响
  • 3 讨论
  • 第二节 姬松茸和灰树花多糖的体外抗肿瘤研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 3 讨论
  • 第三节 姬松茸和灰树花多糖诱导人脐血GM-CSF基因表达的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 姬松茸多糖对人脐血GM-CSF基因诱导表达的影响
  • 2.2 灰树花多糖对人脐血GM-CSF基因诱导表达的影响
  • 3 讨论
  • 第四节 姬松茸和灰树花多糖的抗衰老活性研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果分析
  • 2.1 姬松茸和灰树花多糖对果蝇寿命的影响
  • 2.2 姬松茸和灰树花多糖对果蝇SOD活性值的影响
  • 2.3 姬松茸和灰树花多糖对果蝇MDA含量的影响
  • 2.4 姬松茸和灰树花多糖对果蝇总抗氧化能力的影响
  • 3 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录1 姬松茸分子标记鉴定相似性系数矩阵表
  • 附录2 灰树花分子标记相似性系数矩阵表
  • 致谢
  • 相关论文文献

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