H9亚型禽流感病毒检测方法的建立及应用

论文摘要

禽流感（Avian influenza, AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）引起的病毒性烈性传染病。AIV是分节段单股负链RNA病毒,分为A,B和C型,有17个血凝素（HA）亚型和10个神经氨酸酶（NA）亚型。H9N2亚型流感病毒虽然为低致病性流感病毒,但该病毒具有人类流感病毒样受体特异性,它可以跨物种从家畜传播给人类。这就预示着H9N2亚型AIV可能成为下一次流感大流行的潜在病毒毒株,对公共卫生造成严重的危害。鉴于H9N2亚型AIV对人类及养殖业的威胁,本研究制备了抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,并建立了H9亚型AIV双抗体夹心ELISA检测方法和H9亚型AIV胶体金免疫试纸条检测方法,为H9亚型AIV的抗原检测和流行病学调查奠定了良好的基础。此方法具有操作简单、结果判断直观,敏感性高,特异性强的优点。主要的实验方法和结果如下：1.H9亚型AIV单抗的制备及特性用从西藏病鸡中分离得到的H9亚型AIV A/Chicken/Tibet/S1/2009毒株为抗原,经过扩增和纯化,对5-8周龄BALB/c小鼠免疫,取免疫小白鼠的脾细胞研磨后与注射小鼠背部皮下的SP2/0形成的瘤细胞进行融合。采用ELISA和HI的方法筛选阳性的细胞,将每次筛选到的阳性杂交瘤细胞进行克隆,经过三次的有限稀释法克隆后,得到6株针对H9亚型流感病毒HA特定位点的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株5G2、4E8、4D10、5E1、4A9、2E12腹水的HI效价在214-218之间,6株单克隆抗体均与H9亚型AIV发生血凝抑制反应,对其它亚型AIV反应结果为阴性,具有良好的特异性。2.H9亚型AIV ELISA检测方法的建立及应用H9亚型AIV双抗体夹心ELISA是用单克隆抗体4D10为包被抗原,HRP4D10为酶标二抗,建立的检测方法。用此方法对H1亚型、H3亚型、H5亚型的流感毒进行检测,结果均为阴性；用此方法对NDV、EDSV、IBDV等畜禽类主要病毒进行检测,结果也为阴性,证明ELISA方法特异性高。H9亚型双抗体夹心试剂盒最低检测病毒量为10-2.3TCID50,临界值为0.211。该方法与病毒分离的敏感性和特异性相比较分别为98.9%和98.1%。检测临床样本与RT-PCR比较,ELISA方法的阳性率达到94.3%,阴性检出率为100%。H9亚型AIV双抗体夹心ELISA试剂盒的研制,弥补了目前市场上的空白,此试剂盒能够准确、快速检测出H9亚型AIV,对H9亚型AIV的评估、预防及流行病学调查意义重大。3.H9亚型AIV胶体金试纸条检测方法的建立及应用应用柠檬酸钠还原法制备的胶体金颜色为酒红色,颗粒大小均一、最大吸收峰在520nm处。用单克隆抗体5E1标记胶体金,最适抗体蛋白的标计量为24μg/mL。在硝酸纤维膜（NCM）上分别包被H9N2亚型AIV多抗和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线组装成胶体金试纸条。质控线蛋白量为1mg/mL,检测线蛋白量为1.5mg/mL;胶体金的最低检测病毒稀释度为1:64（10-2.7TCID50）。在动物临床试验中,用间接ELISA和胶体金试纸条对发病鸡的喉头拭子和组织病料进行检测,阳性检出符合率为94%。用本方法将H9N2亚型AIV标准抗原及本实验室分离的7株H9N2亚型AIV进行检测其结果均为阳性；将H1、H3、H5和H7亚型AIV标准抗原、新城疫病毒,传染性支气管炎病毒,减蛋综合症病毒的抗原用本方法检测结果均为阴性。说明本试验制备的H9亚型AIV快速检测试纸条具特异性强、易于判读、操作简便等优点,可用于AIV H9N2亚型AIV的特异诊断和流行病学调查,为临床诊断提供有效的工具。4.临床应用采集发病鸡的心,肝,脾,肺,肾,脑,喉头拭子,组织匀浆后取上清用ELISA和胶体金检测结果发现：攻毒后3-5d体内各器官的病毒量呈现增加趋势,其中肺脏和器官的组织含毒量最高。该研究表明,本试验研制的ELISA和胶体金检测试剂盒可以应用于临床样本的检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbrevation）
• 1 文献综述
• 1.1 AIV概述
• 1.1.1 AIV结构和功能
• 1.1.2 HA结构与功能
• 1.2 H9亚型AIV
• 1.2.1 H9亚型AIV形态结构
• 1.2.2 H9N2亚型AIV流行情况
• 1.2.3 H9N2亚型AIV的种间传播
• 1.2.4 H9N2亚型AIV的分子特性
• 1.3 流感病毒的诊断方法
• 1.4 单抗的研究与发展
• 1.5 研究目的与意义
• 2 H9亚型AIV单抗制备及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 材料及设备
• 2.1.4 实验用试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗原制备
• 2.2.2 免疫BALB/c小鼠
• 2.2.3 细胞融合
• 2.2.3.1 SP2/0瘤细胞的制备
• 2.2.3.2 免疫脾细胞的制备
• 2.2.3.3 饲养细胞的制备
• 2.2.3.4 细胞融合
• 2.2.4 阳性瘤细胞的筛选
• 2.2.5 阳性瘤细胞的克隆
• 2.2.6 单抗的鉴定方法
• 2.2.6.1 杂交瘤细胞染色体计数
• 2.2.6.2 单克隆抗体的亚类鉴定
• 2.2.6.3 单克隆抗体生产
• 2.2.6.4 腹水中单克隆抗体HI效价的测定
• 2.2.6.5 特异性检测
• 50测定'>2.2.6.6 病毒TCID₅₀测定
• 2.2.6.7 间接免疫荧光检测
• 2.2.6.8 杂交瘤细胞冻存和复苏
• 2.2.6.9 单克隆抗体稳定性鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 克隆后结果
• 2.3.2 阳性瘤细胞染色体计数
• 2.3.3 亚类鉴定及染色体数目
• 2.3.4 单抗血凝抑制效价
• 2.3.5 检测单抗特异性
• 2.3.6 阳性瘤细胞IFA检测
• 2.3.7 阳性瘤细胞稳定性结果
• 2.4 讨论
• 3 H9亚型AIV双抗体夹心ELISA方法的建立及应用
• 3.1 材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.1.3.1 单克纯化和标记用溶液
• 3.1.3.2 试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 单抗腹水纯化
• 3.2.2 抗体浓度及效价的测定
• 3.2.3 HRP标记单抗
• 3.2.4 H9亚型AIV ELISA方法建立
• 3.2.4.1 双抗体夹心ELISA方法步骤
• 3.2.4.2 包被抗体和酶标抗体配对的选择
• 3.2.4.3 棋盘滴定法确定抗体浓度
• 3.2.4.4 确定临界值
• 3.2.4.5 选择封闭液
• 3.2.4.6 选择温育时间
• 3.2.4.7 特异性试验
• 3.2.4.8 敏感性实验
• 3.2.4.9 临床试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 单克隆抗体的提纯及检测
• 3.3.2 确包被抗体和酶标抗体最佳配对
• 3.3.3 棋盘滴定法确定抗体浓度
• 3.3.4 确定临界值
• 3.3.5 选择封闭液
• 3.3.6 ELISA的特异性
• 3.3.7 ELISA的敏感性
• 3.3.8 临床试验
• 3.4 讨论
• 4 H9亚型AIV胶体金检测方法建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验用生物材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 试剂的配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 器皿的硅化
• 4.2.2 金溶液的制备
• 4.2.3 金溶液抗体的制备
• 4.2.4 处理结合垫和样品垫方法
• 4.2.5 抗体喷涂及金垫制备
• 4.2.6 胶体金试纸条组成
• 4.2.7 鸡抗AIV多克隆抗体的制备及纯化
• 4.2.8 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择
• 4.2.9 试纸条的特异性
• 4.2.10 试纸条的敏感性
• 4.2.11 H9亚型AIV检测
• 4.2.12 试纸条的稳定性
• 4.3 结果
• 4.3.1 试纸条检测方法的建立
• 4.3.1.1 金颗粒的制备
• 4.3.1.2 5E1单抗蛋白量的确定
• 4.3.1.3 标记用缓冲液的选择
• 4.3.1.4 抗体标记后的胶体金结果
• 4.3.1.5 鸡多抗AIV H9-IGg、羊抗鼠IgG喷涂量的确定
• 4.3.1.6 试纸条的判断标准
• 4.3.2 特异性试验
• 4.3.2.1 检测畜禽类病毒
• 4.3.2.2 检测其它亚型病毒
• 4.3.3 试纸条的敏感性
• 4.3.4 H9亚型AIV检测
• 4.3.5 试纸条的重复性
• 4.3.6 试纸条的稳定性
• 4.4 临床应用试验
• 4.5 讨论
• 5 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录