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驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析

2020-12-08阅读(412)

驴新型Cathelicidin的基因克隆、多肽鉴定和功能分析

论文摘要

在此项研究中,为鉴定新型Cathelicidin抗微生物肽,我们以家畜驴为研究对象,构建了驴肺脏cDNA文库;使用半巢式PCR的方法,从该cDNA文库中克隆得到两种新型Cathelicidin家族抗微生物肽:Ea-CATH1和Ea-CATH2。它们分别由25（KRRGSVTTRYQFLMIHLLRPKKLFA）和26（KGRGSETTRYQFVPVHFFPWNKLS DF）个氨基酸残基组成,与目前已鉴定的其它物种内源性Cathelicidin抗微生物肽相比,没有序列同源性。它们均是碱性多肽,分别含有7个和4个碱性氨基酸残基;两者的分子量均很小,分别为3060.75 Da和3144.54 Da。在所筛选的32株细菌和真菌中,化学合成的EA-CATH1小肽对大部分菌株均有很强的杀菌活性,尤其是临床分离的耐药性菌株;Ea-CATH1对其中革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（MIC）大多在0.3-2.4μg/ml范围内。Ea-CATH1的抗菌活性在人血清中表现相当稳定,与血清在37℃孵育3天后,仍能发挥较强的抗菌能力;而且在高达20μg/ml的剂量下（远高于对应的MIC）,Ea-CATH1对人血红细胞仅显示极微弱的溶血性（1.8%）。圆二色谱显示,Ea-CATH1在模拟生物膜结构的50%TFE/ H2O溶液中主要呈现α-螺旋结构,但是在水溶液中主要采用无规则卷曲结构。在体外,0.6μg/ml的Ea-CATH1可以在2小时内彻底杀死106CFU/ml的金黄色葡萄球菌（ATCC2592）,远胜于传统抗生素氨苄青霉素。利用扫描电子显微镜（SEM）观察经Ea-CATH1处理半小时的金黄色葡萄球菌（ATCC2592）,结果证明Ea-CATH1能迅速破坏细菌的细胞壁和细胞膜,从而导致细胞裂解,细菌死亡;这或许是由杀菌动力学数据揭示的Ea-CATH1杀菌速度比传统抗生素快很多的原因。在CaCl2存在的条件下,Ea-CATH1表现明显的红细胞凝集活性,说明它可能抑制细菌分泌的多聚蛋白与宿主红细胞表面相互作用,从而限制细菌的繁殖和传播。在生理pH值附近的磷酸盐缓冲液（PBS）中,20μg/ml的Ea-CATH1表现较高的肥大细胞脱颗粒活性,说明它可能还是一种免疫效应分子,在宿主防御系统中介导重要的免疫反应。以上诸多特征和活性证明,Ea-CATH1很有希望成为一种先导化合物,并设计开发出新型抗微生物药物。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 文献综述
  • 1.1 Cathelicidin 的研究历史
  • 1.2 Cathelicidin 的定义
  • 1.3 Cathelicidin 成熟肽的结构多样性
  • 1.4 Cathelicidin 成熟肽的抗微生物活性和机制
  • 1.4.1 抗微生物活性
  • 1.4.2 抗微生物机制
  • 1.5 Cathelicidin 的物种分布
  • 1.6 Cathelicidin 的组织分布
  • 1.7 Cathelicidin 基因
  • 1.7.1 Cathelicidin 基因的结构
  • 1.7.2 Cathelicidin 基因在染色体中的定位
  • 1.8 Cathelicidin 的生物合成和调控
  • 1.8.1 Cathelicidin 的合成和活化
  • 1.8.2 Cathelicidin 生物合成的调控
  • 1.9 Cathelicidin 在医疗保健中的应用前景
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 分子克隆菌株和质粒载体
  • 2.1.3 酶及分子生物学试剂
  • 2.1.4 生物化学试剂
  • 2.1.5 多肽
  • 2.1.6 抗菌测试菌株
  • 2.2 耗材和仪器设备
  • 2.2.1 耗材
  • 2.2.2 仪器设备
  • 2.3 方法
  • 2.3.1 驴cathelicidin 基因cDNA 的克隆方法
  • 2.3.2 驴cathelicidin 基因在各组织中的表达
  • 2.3.3 多肽的鉴定与结构分析
  • 2.3.4 构建cathelicidin 超级蛋白家族成员系统进化树
  • 2.3.5 Ea-CATH1 的抗菌活性分析
  • 2.3.6 Ea-CATH1 的杀菌动力学
  • 2.3.7 影响 Ea-CATH1 抗菌活性的因素测定
  • 2.3.8 Ea-CATH1 的溶血活性分析
  • 2.3.9 Ea-CATH1 的红细胞凝集活性分析
  • 2.3.10 Ea-CATH1 的肥大细胞脱颗粒活性分析
  • 2.3.11 Ea-CATH1 对细菌细胞形态的影响
  • 3 结果与分析
  • 3.1 RNA 和cDNA 的质量检测
  • 3.2 半巢式PCR
  • 3.3 菌落PCR 鉴定
  • 3.4 测序结果分析
  • 3.5 Ea-CATH1 在驴不同组织中的表达差异
  • 3.6 Ea-CATH1 的鉴定与特征
  • 3.6.1 驴Cathelicidin 的鉴定与序列分析
  • 3.6.2 驴Cathelicidin 成熟肽的预测
  • 3.6.3 Ea-CATH1 的理化特征
  • 3.6.4 驴cathelicidin 与其它代表性cathelicins 的氨基酸序列比对
  • 3.7 Ea-CATH1 的二级结构
  • 3.7.1 二级结构的初步分析
  • 3.7.2 圆二色谱分析
  • 3.8 Cathelicidin 蛋白家族的系统进化树
  • 3.9 Ea-CATH1 的抗菌活性及杀菌动力学
  • 3.9.1 Ea-CATH1 的化学合成
  • 3.9.2 Ea-CATH1 的抗菌活性筛选
  • 3.9.3 最小抑菌浓度（MIC）
  • 3.9.4 Ea-CATH1 的杀菌动力学
  • 3.10 血清和pH 值对Ea-CATH1 抗菌活性的影响
  • 3.10.1 Ea-CATH1 的血清稳定性
  • 3.10.2 pH 值对Ea-CATH1 抗菌活性的影响
  • 3.11 Ea-CATH1 的其它生物学活性检测
  • 3.11.1 溶血活性
  • 3.11.2 红细胞凝集活性
  • 3.11.3 肥大细胞脱颗粒活性
  • 3.12 Ea-CATH1 对细菌细胞形态的影响
  • 4 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间取得的科研成果清单

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