灵芝产漆酶条件的优化与漆酶的纯化及部分性质研究

论文摘要

本试验对灵芝产漆酶条件进行研究，确定其产酶培养基的最佳碳源及最优碳源浓度，最佳氮源及最优氮源浓度，最佳起始pH值，以及产漆酶最佳诱导金属离子及其最优浓度，以筛选出的四个培养条件为四个因素，分别设定五个作用水平，通过旋转正交实验得到最佳培养基组成为（g／L）：葡萄糖3％，酵母浸膏0．1％，KH2PO40．3％；MgSO4·7H2O 0．1％：Cu2+2．854mmol／L；VB10．01％；高压灭菌后pH为2．60。试验通过真空抽滤、（NH4）2SO4分级沉淀、透析、聚乙二醇6000浓缩、磷酸盐缓冲液（0．01mol／L，pH5．8）为洗脱液的DEAE-cellulose阴离子交换层析柱（1．6cm×40cm）层析等步骤对粗酶液进行了纯化。用紫外分光光度计测定收集液在280nm处的吸光值，并对有吸收峰的收集液进行了漆酶酶活检测，确定洗脱液盐浓度为0．2mol／L NaCl时可分离得到漆酶，在此基础上采用SDS-PAGE电泳对所得漆酶进行纯度鉴定，试验结果表明最终纯化倍数达3．6，活力回收率为49．1％。试验确定了纯化的灵芝漆酶的部分酶学性质。纯化漆酶的分子量约为45KDa；纯化漆酶最适作用温度为75℃，在40℃-65℃之间热稳定性较好，对70℃以上的高温敏感；纯化漆酶的最适反应pH范围为3．0-3．6，在pH3．0-5．0之间酸碱稳定性较好，pH值越高漆酶越不稳定；金属离子对纯化漆酶活力的影响很大，当金属离子浓度为50mmol／L时，Na+和Zn2+对漆酶活性无明显影响，Cu2+、Mn2+和Mg2+对漆酶活性有明显的促进作用，而Ag+和Fe2+离子对漆酶酶活有强烈的抑制作用。其中Cu2+的激活作用最好，Ag+的抑制作用最强烈；30℃时，灵芝漆酶氧化2，2’-连氮基-二-（3-乙基苯并噻锉-6-磺酸）（ABTS）的米氏常数Km值为186μmol／L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 漆酶来源、特性及催化反应机理
• 1.1.1 漆酶的主要来源
• 1.1.2 漆酶的化学组成和结构
• 1.1.3 漆酶催化反应机理
• 1.2 漆酶研究进展
• 1.2.1 漆酶的底物和介质系统的作用机理
• 1.2.2 漆酶发酵条件的研究
• 1.2.3 漆酶蛋白纯化的研究
• 1.2.4 漆酶的分子生物学研究
• 1.3 漆酶的应用前景
• 1.3.1 漆酶在制浆造纸中的应用
• 1.3.2 漆酶在生物治理中的作用
• 1.3.3 漆酶在高分子化合物合成中的作用
• 1.3.4 漆酶在生物传感器中的应用
• 1.3.5 漆酶在食品工业中的应用
• 1.4 本研究的目的与主要内容
• 第二章 灵芝产漆酶条件的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 使用仪器
• 2.1.4 培养基的配制
• 2.1.5 分析方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 最佳碳源的筛选及其浓度的确定
• 2.2.2 最佳氮源的筛选及其浓度的确定
• 2.2.3 最佳初始pH值的确定
• 2.2.4 金属离子对灵芝产漆酶的影响
• 2+浓度的确定'>2.2.5 最佳Cu²⁺浓度的确定
• 2.2.6 旋转正交法优化灵芝产漆酶培养基
• 2.3 讨论
• 第三章 灵芝漆酶的分离纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 使用仪器
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 分析方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 样品纯化结果
• 3.2.2 漆酶纯度的鉴定和分子量的测定
• 3.3 讨论
• 第四章 灵芝漆酶部分性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 使用仪器
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 漆酶蛋白分子量的测定
• 4.2.2 温度对漆酶活性的影响及热稳定性
• 4.2.3 pH值对漆酶活性的影响及其酸碱稳定性
• 4.2.4 金属离子对漆酶活性的影响
• 4.2.5 漆酶的米氏常数
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学位论文
• 致谢