导读:本文包含了人工突变论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CRISPR,Cas9,elF4E,PVY,瞬时转化
人工突变论文文献综述
付紫梅[1]（2018）在《加工番茄eIF4E和eIF(iso)4E基因人工突变体的培育及其对PVY病毒抗性的研究》一文中研究指出真核翻译起始因子eIF4E(eukaryotic translation inititon factor 4E)是一个大的基因家族,由多个基因编码,在生物体中行使重要的生物学功能。在番茄中已鉴定的编码eIF4E的基因有叁个,分别为eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E。前期研究发现马铃薯Y病毒的VPg蛋白((viral genome-linked protein,VPg)能够选择性地利用eIF4E来协助病毒mRNA的翻译和在寄主细胞间的扩散。目的:利用CRISPR/Cas9技术分别构建能够特异性地靶向编辑加工番茄eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的载体。以构建的eIF4E1基因的靶向编辑载体为例,通过瞬时转化的方法快速获知载体的有效性后分别遗传转化加工番茄,不仅为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持,同时也为新疆加工番茄的品种改良奠定基础。方法:以实验室前期构建的CRISPR/Cas9系统原件为基础,利用Vector NTI生物学软件分别选取了eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的靶序列,以此为基础,构建能够靶向加工番茄eIF4E1、eIF4E2、和eIF(iso)4E基因的CRISPR/Cas9系统表达载体;以构建的eIF4E1基因的CRISPR/Cas9靶向编辑载体为例,通过农杆菌介导的瞬时转化的方法来快速获知本研究应用CRISPR/Cas9系统构建的载体的有效性;将利用两套CRIS PR/Cas9系统构建的六个载体分别遗传转化加工番茄;所获得的转基因植株采用限制性内切酶分析法进行突变情况的鉴定。结果与结论:(1)本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建的eIF4E靶向编辑载体由两部分构成。其中含靶序列sgRNA的表达框由RNA聚合酶Ⅲ型的番茄U6启动子进行启动,由于番茄U6启动子的转录起始位点通常是G,所以本研究利用Vector NTI软件设计的靶序列的5'端第1个碱基为G。Cas9蛋白由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子启动并且在N端均添加了核定位信号序列(Nuclean localization signal,NLS)。本研究突变体检测方法采用限制性内切酶分析法,因此设计的靶序列包含特异性的限制性内切酶识别位点。(2)本研究采用了真空渗透的瞬时转化方法来对已构建的CRISPR/Cas9系统载体有效性进行评估,核苷酸序列比对结果显示,已测序的9个阳性克隆都存在突变,并且所有的突变情况均为单碱基的替换,这导致加工番茄eIF(iso)4 E基因靶序列处的多肽链中出现单个氨基酸的替换。(3)瞬时转化后,突变情况检测的酶切电泳结果显示,未切开的条带相对较亮,这表明瞬时转化过程中,被转化的细胞所占的比例较大,同时表明本研究所采用的真空渗透的瞬时转化方法的转化效率较高,可用于后续CRIS PR/Cas9系统应用过程中的靶序列评估实验。(本文来源于《石河子大学》期刊2018-06-01）
李淼[2]（2017）在《增加了Cys残基的小麦1Ax1亚基人工突变体的品质功能研究》一文中研究指出小麦种子储藏蛋白特性决定着小麦终用途品质。其中,高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)通过分子间二硫键与低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)交联形成的麦谷蛋白聚合体是小麦面团品质特性的重要决定因子。而HMW-GSs 1Dx5+1Dy10被普遍认为是小麦麦谷蛋白优质亚基组合,其中1Dx5亚基所特有的中间重复区额外Cys残基推测对于了解面团粘弹性的形成具有十分重要的意义。到目前为止,关于该Cys残基在小麦面粉功能特性中的作用仍不清楚。本文通过人工定点突变,将1Ax1亚基基因中与1Dx5亚基额外Cys密码子位置相对应的Ser密码子替换为Cys密码子,构建了重组质粒p LRPT-Glu-Mut1Ax1和p LRPT-Glu-WT1Ax1;通过基因枪转化法将mut1Ax1/wt1Ax1基因分别转入到普通小麦品种L88-31中;经PCR、Southern blot、RT-PCR和SDS-PAGE技术确证获得了独立的转基因植株。经过连续五代(T0-T4)的筛选,共获得了4个(mut1Ax1)和1个(wt1Ax1)的转基因纯合株系。采用光密度分析、面筋仪2200、揉混仪、排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、马尔文激光粒度仪、电子扫描显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱(FTIR)等技术手段,研究外源Mut1Ax1/WT1Ax1亚基对面团揉混特性、麦谷蛋白大聚合体(GMP)分子量分布、面筋网络结构及二级构象变化、以及二硫键(SS)含量的影响。从而,为更好地了解含有该额外Cys残基的突变亚基对面粉揉混特性及面筋蛋白理化特性的影响以及相关作用机理提供理论依据。本研究主要结果如下:(1)光密度分析结果显示外源基因mut1Ax1与wt1Ax1的表达水平相似;面筋指数和面粉揉混分析结果显示与WT1Ax1亚基相比,Mut1Ax1亚基能显着地提高面筋含量,增强面筋强度和面团抗拉伸特性,表明含有额外Cys残基的Mut1Ax1亚基对面筋强度有正向效应。(2)SE-HPLC、粒度分析、SEM分析结果显示Mut1Ax1较WT1Ax1能显着增加大分子蛋白聚合体含量及GMP颗粒平均粒径,表明前者有利于增强面筋蛋白聚合度及面筋网络的充分形成。(3)转mut1Ax1基因株系面筋样品中SS含量较转wt1Ax1基因株系(WT1Ax1-1)显着增加,表明Mut1Ax1中额外Cys残基参与了分子间二硫键的形成,进而加强了麦谷蛋白亚基分子间的相互作用。而其面筋蛋白二级构象random coil及β-turn向β-sheet的明显转换表明Mut1Ax1亚基更有利于面筋蛋白的有序折迭聚合。Mut1Ax1对面团加工品质特性的影响应归因于其中间重复区额外Cys残基参与形成分子间二硫键,增强亚基间交联度,有利于GMP聚合以形成更为致密的面筋网络,进而牢牢包埋淀粉及其它非可溶性颗粒,加强了面粉多组分间的充分互作,从而改善了面团品质。(本文来源于《华中科技大学》期刊2017-08-01）
罗晓丽,肖娟丽,张安红,王志安,许琦[3]（2016）在《棉花人工突变体的研究进展及其利用展望》一文中研究指出棉花突变体的创造是棉花功能基因组研究的基础。对棉花突变体来源、种类及研究进展进行了总结和评述,提出了未来棉花突变体发掘和创制的方法;并针对棉花突变体研究所面临的问题进行分析,对其利用前景进行了展望。(本文来源于《中国棉花》期刊2016年08期）
苗英杰[4]（2012）在《小麦Puroindoline A基因人工突变体的构建、表达、抗菌活性分析及其在小麦中的功能研究》一文中研究指出小麦籽粒硬度是小麦的最重要的目标性状之一，它直接决定小麦的磨粉品质和烘烤品质，是小麦品质优劣的重要指标。在控制籽粒硬度Ha位点的叁个基因中，Puroindoline(Pina)和Puroindoline(Pinb)是主效基因，编码相对分子量13kDa的强碱性蛋白——PINA和PINB蛋白。这两种PIN蛋白同时存在于小麦胚乳和糊粉层细胞中，并结合在胚乳淀粉粒的表面，大量存在于成熟种子中。PIN蛋白还能够有效抑制许多植物病原菌的生长，对革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌以及真菌具有明显的抗性，并且PINA蛋白的抗菌作用强于PINB蛋白。细菌对抗抗生素的途径主要是通过表达特定的抗性基因分解抗生素，PIN蛋白则主要通过破坏特定脂质成分的病原菌质膜发挥抗菌能力，因此植物抗菌蛋白有望解决病原菌抗药性问题，具有很好的发展潜力。成熟的PIN蛋白具有四个α-螺旋为主的二级结构，五对二硫键把整个分子结构聚合成紧密的球型。前两个α-螺旋之间存在一个含多个疏水Trp残基和碱性Lys、Asp残基的色氨酸结构域(TRD)，很多证据证明TRD与其控制籽粒硬度和抗菌功能紧密相关。本研究构建了含多个色氨酸结构域的Pina基因人工突变体ABBC和ABBBC，以期获得抗菌性更强的植物蛋白，同时探索PIN蛋白决定籽粒硬度的分子机理；通过二级结构和叁级结构的预测，探索和推测PINA两个突变蛋白的分子结构。利用PCR技术，成功地扩增了小麦Pina基因并构建了其含有不同色氨酸结构域(TRD)的人工突变体ABBC和ABBBC，并将其整合到到原核表达载体pET43.1a中，实现了在原核表达菌株Rosetta-gami(DE3)中的高效可溶性表达。采用Ni-NTA亲和层析技术，获得了高纯度和高浓度的PINA、ABBC和ABBBC重组蛋白。通过最低抑菌浓度的测定和荧光显微镜计数评估了重组蛋白的抗菌性变化。结果表明ABBC重组蛋白的抗菌性均明显高于PINA重组蛋白(P<0.05)，其可能成为有潜在的高效抗菌蛋白。而ABBBC重组蛋白的抗菌性均低于PINA重组蛋白，无明显的应用价值。这一结果表明，通过增加TRD的方式可以提高PINA蛋白抗菌性，但是当TRD数量达到3个拷贝时，抗菌性能反而下降。成功将Pina/ABBC/ABBBC构建到真核表达载体pLRPT中，通过金粉包裹，基因枪轰击，转化入四倍体小麦Ofanto中，经过诱导培养，分化培养，筛选培养，春化培养和盆栽培养，获得转基因后代。使用PCR检测，Southern Blot检测，SDS-PAGE检测以及Western Blot检测鉴定出4株转基因T0代植株，并顺利生长结实。(本文来源于《华中科技大学》期刊2012-02-01）
刘二平,韩立影,方琪,秦正红,王进[5]（2011）在《鲑鱼精DNA提高人工突变质粒模板中单核苷酸多态性位点识别的特异性及其应用》一文中研究指出目的探讨等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)检测单核苷酸多态性(SNP)的方法,研究鲑鱼精DNA对优化等位基因特异性引物的作用。方法对鲑鱼精DNA设一系列浓度梯度,分别进行AS-PCR后观察电泳结果。结果鲑鱼精DNA能显着提高识别基因SNP位点的特异性,在25μl的质粒检测系统中加入50 ng的鲑鱼精DNA结果最佳。结论鲑鱼精DNA加入到质粒检测系统中可有效测试所设计的检测引物的特异性,达到模拟基因组DNA的目的 。(本文来源于《苏州大学学报(医学版)》期刊2011年03期）
张羽[6]（2011）在《日本脑炎病毒NJ2008株人工突变致弱及其N-糖基化位点的功能研究》一文中研究指出日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病,与西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)和登革热病毒(Dengue Virus, DENV)等同属于黄病毒科黄病毒属。JEV在鸟与蚊子之间有一个区域性传播循环,猪作为中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病对养猪业的危害主要表现为夏秋季节母猪的繁殖障碍与公猪的睾丸炎,在我国流行面积较大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。由于现阶段对于乙脑尚无治疗的特效手段,因此预防乙脑的发生尤为重要,而疫苗是控制该病发生的最佳手段。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。反向遗传操作(又称感染性克隆)为在DNA水平上研究RNA病毒的基因组结构及功能和病毒宿主相互作用提供了重要手段,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在乙脑病毒上应用以来,在对乙脑病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因、疫苗研制等方面的研究已取得明显进展。本研究构建了两个突变感染性克隆株(突变E138、N154)分别在细胞和动物模型上验证其毒力的变化,为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台；同时构建突变N154的重组真核质粒,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为改良核酸疫苗的潜能。研究主要从以下几方面展开：1猪源乙型脑炎病毒NJ2008株全基因克隆及序列分析猪源乙型脑炎病毒NJ2008株是从南京某猪场流产胎儿的脑组织中分离并在BHK-21细胞上经数次传代,本实验根据乙型脑炎病毒SH0601株的基因组序列设计并合成JEV特异性引物进而应用RT-PCR技术分11段扩增了JEV NJ2008株基因,将所得片段克隆至pMD18-T载体上,经测序后获得了JEV基因组全序列。序列分析表明,该JEV基因组全长10,961bp,含有一个大的开放阅读框架,编码由3432个氨基酸残基组成的聚合蛋白,其5'非编码区(5’UTR)和3'非编码区(3'UTR)分别由95和578个碱基组成,与其它毒株比较发现3'非编码区(3’UTR)的44bp处共缺少16个碱基。通过全基因和E基因的进化树分析可得,猪源乙脑NJ2008株病毒属于基因Ⅲ型,该病毒的全基因与其它32株病毒核苷酸进行比较发现,同源性在99.4%和88%之间,与其它45株病毒E蛋白的核苷酸比较发现,同源性在99.2%和87.7%之间；该病毒的全基因与其它32株病毒氨基酸进行比较发现,同源性在99%和89.1%之间,与其它45株病毒E蛋白的氨基酸比较发现,同源性在99.5%和89.7%之间,突变位点分散于各个区域。与其它16株猪源乙脑病毒E蛋白的氨基酸比较发现,E蛋白的309位氨基酸发生了突变,由酪氨酸(Tyr)-丝氨酸(Ser),并且307-309位为乙型脑炎病毒E蛋白的一个B细胞线形表位。2猪源乙型脑炎病毒NJ2008株感染性克隆的构建及鉴定本实验根据猪源乙型脑炎病毒NJ2008株基因组序列设计并合成JEV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分4段扩增了JEV NJ2008株全基因组cDNA。将扩增的1、2两个片段通过重迭PCR的方法扩增出JEV 5'cDNA,将扩增的3、4两个片段通过重迭PCR的方法扩增出JEV 3'cDNA。在扩增5’前端时,引入T7启动子序列用于后期的体外转录得到病毒的转录本,在基因组5’前端和3’末段分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点,最后将5'cDNA和3'cDNA连入pBluescriptⅡKS载体,构建的质粒命名为pSK-SUP、pSK-HYP。进一步的酶切鉴定及接头处序列测定的结果表明,成功获得了NJ2008株基因组全长cDNA克隆。用SalⅠBamHⅠ双酶切质粒pSK-SUP,用BamHⅠ、KpnⅠ酶切已经构建好的质粒pSK-HYPO,然后通过体外连接获得全长基因组。体外连接的全长基因组转录合成病毒RNA,转染BHK-21细胞,72h后将转染病毒RNA细胞冻溶1次后接种BHK-21细胞,拯救出病毒。通过间接免疫荧光证明病毒拯救成功,并且比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及分子生物学特性没有显着差异。通过测序分析,拯救病毒的氨基酸与亲本毒共有3个氨基酸的差异,尚没有文献报道该病毒的毒力与这3个氨基酸有关。以上结果表明JEV强毒株NJ2008株感染性克隆构建成功,建立了JEV疫苗株的反向遗传操作系统,为研究JEV的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。3猪源乙脑病毒E138位突变株感染性克隆的构建与病毒拯救日本脑炎病毒E蛋白的138位氨基酸对于该病毒的毒力强弱起到至关重要的作用,所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白138位谷氨酸(Glu)突变为赖氨酸(Lys),构建了突变株的全基因感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本感染性克隆株对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/3。另外,在小鼠脑内接种同剂量的亲本株病毒和E138突变感染性克隆病毒,接种E138突变感染性克隆病毒株的小鼠的致病力大大降低。该实验将为猪源乙型脑炎病毒减毒活疫苗的研制提供了一个良好平台。4猪源乙脑病毒NJ2008株N-糖基化位点的突变影响病毒的复制、胞内定位以及致病力日本脑炎病毒E蛋白仅含有一个糖基化位点,N154-N-T。已经有文献报道,有些病毒E蛋白糖基化位点的改变会影响病毒的形态、感染力以及免疫应答,但乙型脑炎病毒该位点的突变是否影响病毒的感染力或致病力尚不清楚。所以本研究以乙脑病毒NJ2008株全长感染性克隆为亲本,利用反向遗传技术将该病毒的E蛋白154位天冬酰胺(Asn)突变为丙氨酸(Ala),构建了N154突变株的感染性克隆。将其转染乳仓鼠肾细胞(BHK-21),72h后出现病变,并在BHK-21细胞中盲传3代,通过病毒蚀斑形成试验、间接免疫荧光和荧光定量RT-PCR等方法与亲本株病毒对比分析其感染性的差异。结果表明,突变病毒的蚀斑数和荧光数明显比亲本株少,在感染2-3d后,细胞内病毒RNA的量大约是亲本株的1/2。通过激光共聚焦显微镜观察到,在感染BHK-21细胞的早期(24h),突变N154病毒与亲本毒的蛋白在细胞内的定位有所不同,突变N154病毒的蛋白在细胞中呈现明显的聚积。突变株病毒脑内接种乳鼠,对乳鼠致病力有所下降。由此可以看出,E蛋白糖基化位点的突变降低了乙脑病毒的复制、影响了蛋白在胞内的折迭以及降低了病毒的致病力,这也将为猪源乙型脑炎病毒弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。5猪源乙脑病毒prM-E蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建PrM和E蛋白是乙型脑炎病毒两个重要的囊膜蛋白,将prM、E基因及prM的信号肽序列插入真核表达质粒pVAXI中构建重组真核质粒pVAXI-prME,其中prM和E各含有一个糖基化位点(N15,N154),单独或联合突变其糖基化位点,将天冬酰胺(N)突变成丙氨酸(A),构建3株突变的重组真核质粒pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,重组质粒转染VERO细胞,利用间接免疫荧光证明亲本与3株突变的重组质粒在真核细胞内能有效的转录和表达；通过肽N-糖苷酶F (PNGase F)作用后,Western-blot检测表明突变糖基化位点的重组真核质粒表达产物的分子量小于亲本质粒的表达产物,并而这些重组质粒都能与JEV单克隆抗体特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。6猪源乙脑病毒prM、E蛋白N-糖基化位点对Balb/c小鼠的特异性免疫影响为了评价构建的亲本和突变重组真核质粒的免疫效力,将这4株重组真核质粒作为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。将6周龄Balb/c小鼠随机分成5组,每组14只,设pVAXI-prME、pVAXI-prME-M1、pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3共4个免疫组,同时设pVAXI空载体对照组,肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为100μg/只。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体和细胞因子(IL-4,IL-2和IFN-γ),并做了攻毒保护试验来衡量突变N154的重组质粒的免疫效果。结果表明：重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3,即突变E基因的N154后,既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,且体液免疫水平比pVAXI-prME高。抗体亚型分析结果表明,突变N154的重组质粒既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG1为主；同时细胞因子检测结果进一步表明突变N154的重组质粒主要诱导Th2型细胞因子(IL-4)的产生,因此说明其主要诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明重组质粒pVAXI-prME-M2、pVAXI-prME-M3色完全保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,因此通过突变E基因154位糖基化位点的DNA疫苗可以明显的提高体液免疫应答,并且可以为改良的JEV核酸疫苗提供依据。(本文来源于《南京农业大学》期刊2011-05-01）
王亚娟[7]（2010）在《小麦磨粉品质相关基因pina人工突变体的遗传转化研究》一文中研究指出PIN蛋白是非常重要的品质蛋白,包括两种同源性很高的蛋白PINA和PINB,PIN蛋白直接决定小麦的籽粒硬度,并且具有天然的抗菌特性。编码这两个蛋白的基因pina和pinb位于5DS上,它们具有特殊的多色氨酸结构域,推测其与PIN蛋白的功能密切相关。为了验证色氨酸结构域与PIN蛋白功能之间的关系,我们构建了含不同数量色氨酸结构域的pina人工突变体,本研究在此基础上构建了pina基因人工突变体的真核表达载体,并以硬粒小麦Ofanto为试验受体材料,运用基因枪法,将外源Pina基因的人工突变体ABBC和ABBBC转入到不含pina基因的四倍体硬粒小麦Ofanto中,并运用PCR和SDS-PAGE的方法对Ofanto转基因后代进行分子鉴定。研究结果如下:(1)以植物表达载体pLRPT为基础,构建了以胚乳特异表达启动子1Dx5驱动的Pina基因突变体的真核表达载体pLRPT-ABBC和pLRPT-ABBBC,并运用基因枪的方法进行转化硬粒小麦Ofanto幼嫩盾片。(2)对组培条件进行优化,并使用优化后的条件进行组织培养,获得800余株再生苗。(3)根据pina基因的序列,设计合适的PCR引物,探索并优化PCR条件,运用PCR的方法对转基因苗进行鉴定,并筛选到13株阳性转基因植株。(4)采用优化的SDS-PAGE方法,对PCR检测的阳性转基因植株后代PINA突变体蛋白的表达进行了分析,共获得外源基因正确表达植株8株。本实验所得到的转基因后代为进一步研究pina基因决定小麦籽粒硬度和抗菌特性的机理奠定了基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2010-11-01）
朱丽萍,廖乾生,吴鹏,陈集双[8]（2007）在《CMV卫星RNA人工突变体在烟草上复制和积累的研究》一文中研究指出卫星 RNA(satellite RNA,satRNA)是一类伴随植物病毒侵染、依赖于后者进行复制、包被和运输的亚病毒小 RNA 分子。我们筛选获得一株能够伴随辅助病毒 CMV-Fny 复制,但其5′端比大部分 CMV-satRNA 缺少2个碱基的卫星 RNA(2msat)。本研究通过 PCR 技术在其5′端 (5′-GUUGUUUG……-3′)进行“碱基加/减”,获得了一系列人工构建的2m 衍生突变体： 2mF1((2m-U,5′-GUGUUUG……-3′)、2mF2(2m-UU,5′-GGUUUG……-3′)、2mF3(2m-UUG, 5′-GUUUG……-3′)、2mF4(2m+U,5′-GUUUGUUUG……-3′)、2mF5(2m+UU,5′-GUUUUGUUUG……-3′)、 2mF6(2m-GUUG,5′-UUUG……-3′)和2mF7(2m-GUUGU,5′-UUG……-3′)。2msat 及其突变体的体外转录产物分别与 CMV-Fny 病毒 RNA 混合接种普通烟(Mcotiana tabaccum),进行假重组分析。接种3d,RT-PCR 检测接种叶上 satRNA 复制的结果表明：2msat 的5′端缺失1～3个碱基,或者在5′端的第一个 G 后面添加 U 或 UU,其相应突变体均可依赖 CMV-Fny 在烟草中进行复制；而一旦5′端的4个碱基(GUUG)被缺失,2msat 则不能复制。因此,2msat 的5′端至少必须具有 GUUU 元件,才能在烟草中进行复制。接种7d、14d 和21d,RT-PCR 检测 satRNA 在系统叶中复制的结果显示：接种7d,2msat 及其突变体均存在于寄主组织中；接种14d,系统叶中检测到2mF3sat、2mF4sat 和2mF5sat,而不能检测到2mF1sat 和2mF2sat；接种21d,系统叶中只能检测到2mF4sat 和2mF5sat。不同接种时间,用 Real-time RT-PCR 分析接种叶和系统叶组织中卫星 RNA 的相对含量,结果如下,接种3d,2msat、2mF1sat、2mF2sat、2mF3sat、2mF4sat 和 2mF5sat 在接种叶相对含量之比为1：1．05：1．93：1．59：1．98：1．57；接种5d,其相对含量依次为1：0．91：1．26：0．85：1．17：1．08,以上结果说明在接种叶中卫星 RNA5′端结构改变对2msat 的积累量影响没有明显的差异。在系统叶中,2msat 及其突变体的含量为2mF4sat＞2mF5sat＞ 2mF3sat＞2msat＞2mF1sat＞2mF2sat,并且在3个检测时间,2mF4sat 的含量均远高于其它突变体。上述结果表明：5′端结构不仅直接与 CMV 卫星 RNA 复制相关,还可能影响卫星 RNA 在寄主中的积累量。(本文来源于《中国植物病理学会2007年学术年会论文集》期刊2007-08-01）
王珏[9]（2006）在《小麦Puroindoline蛋白的提取与puroindoline a基因人工突变体构建》一文中研究指出puroindoline基因(pin)位于小麦5D染色体短臂上的Hardness (Ha)位点,它包括puroindoline a基因(pina)和puroindoline b基因(pinb),它们共同控制着小麦籽粒硬度。这两个基因分别编码Puroindoline A (PinA)和Puroindoline B (PinB)两种蛋白,它们位于淀粉粒和蛋白基质表面,是小麦籽粒硬度的生化标记。PinA蛋白和PinB都有一个富含色氨酸的结构域,它是Pin的主要功能基团,这个富含色氨酸的结构域除了影响籽粒硬度外,还具有较强的抗菌活性,对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有较强的抗菌作用。为了研究Pin蛋白的这些功能,本论文从蛋白质水平和分子水平出发,分别用生化的手段和分子生物的方法,对Pin蛋白展开研究。在蛋白质水平上,我们用含4%Triton X-114、pH 7.8的100mM Tris-HCl缓冲液从市售的蛋糕面粉中提取Puroindoline蛋白,蛋白质混合溶液分别用分子筛葡聚糖G-75纯化和离子交换柱羧甲基纤维素(CM-23)进行分离和纯化,得到了Pin蛋白。在分子水平的研究中,我们选取pina基因作为研究对象,用分子生物学的手段和亚克隆的方法,旨在构建具有更强抗菌活性的pina人工突变体。本文成功提取和纯化了野生Pin蛋白,在提取过程中,摸索了提取过程中蛋白质分离纯化的条件,丰富了提取过程中的实验参数,提高了实验的成功率,另外,在构建突变体方面,针对pina基因的色氨酸功能结构域,设计构建含有多个色氨酸功能结构域的pina基因突变体。通过长期的各个方面的条件摸索、不断改进,虽然目前只是得到的是已经改变了阅读框的pina基因突变体,但是已经建立起有效成熟的构建方法,继续应用这种方法,就可以得到我们所预想的突变体。这两个方面的工作都为将来更为深入的研究Pin蛋白的功能打下了坚实的基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2006-05-01）
金波,陈集双,张华荣[10]（2005）在《黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建及其侵染性测定》一文中研究指出从1个369nt的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)卫星RNA的cDNA出发,采用DNA改组技术构建人工突变体,经过体外转录,将其与不携带卫星RNA的黄瓜花叶病毒株进行假重组,鉴定突变体的生物活性,结果显示所获得的4个卫星RNA的点突变子MS1、MS5、MS6和MS11中,只有MS11仍然具有复制能力;而其他3个点突变子,尽管均只有1个位点的替换,却不能在辅助病毒作用下复制。序列比较分析发现MS11的突变位点位于卫星RNA变异区内,发生的突变与自发突变一致,其他3个突变子的突变位点发生在卫星RNA的高度保守区。而且通过侵染性试验证实突变子MS11与野生型Yi没有明显的差异。由此可推测卫星RNA序列中的高度保守区与卫星RNA的生物活性密切相关,个别碱基的突变会导致RNA二级结构的改变,进而引起其复制能力或稳定性的完全丧失。(本文来源于《微生物学报》期刊2005年04期）
人工突变论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
小麦种子储藏蛋白特性决定着小麦终用途品质。其中,高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)通过分子间二硫键与低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)交联形成的麦谷蛋白聚合体是小麦面团品质特性的重要决定因子。而HMW-GSs 1Dx5+1Dy10被普遍认为是小麦麦谷蛋白优质亚基组合,其中1Dx5亚基所特有的中间重复区额外Cys残基推测对于了解面团粘弹性的形成具有十分重要的意义。到目前为止,关于该Cys残基在小麦面粉功能特性中的作用仍不清楚。本文通过人工定点突变,将1Ax1亚基基因中与1Dx5亚基额外Cys密码子位置相对应的Ser密码子替换为Cys密码子,构建了重组质粒p LRPT-Glu-Mut1Ax1和p LRPT-Glu-WT1Ax1;通过基因枪转化法将mut1Ax1/wt1Ax1基因分别转入到普通小麦品种L88-31中;经PCR、Southern blot、RT-PCR和SDS-PAGE技术确证获得了独立的转基因植株。经过连续五代(T0-T4)的筛选,共获得了4个(mut1Ax1)和1个(wt1Ax1)的转基因纯合株系。采用光密度分析、面筋仪2200、揉混仪、排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、马尔文激光粒度仪、电子扫描显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱(FTIR)等技术手段,研究外源Mut1Ax1/WT1Ax1亚基对面团揉混特性、麦谷蛋白大聚合体(GMP)分子量分布、面筋网络结构及二级构象变化、以及二硫键(SS)含量的影响。从而,为更好地了解含有该额外Cys残基的突变亚基对面粉揉混特性及面筋蛋白理化特性的影响以及相关作用机理提供理论依据。本研究主要结果如下:(1)光密度分析结果显示外源基因mut1Ax1与wt1Ax1的表达水平相似;面筋指数和面粉揉混分析结果显示与WT1Ax1亚基相比,Mut1Ax1亚基能显着地提高面筋含量,增强面筋强度和面团抗拉伸特性,表明含有额外Cys残基的Mut1Ax1亚基对面筋强度有正向效应。(2)SE-HPLC、粒度分析、SEM分析结果显示Mut1Ax1较WT1Ax1能显着增加大分子蛋白聚合体含量及GMP颗粒平均粒径,表明前者有利于增强面筋蛋白聚合度及面筋网络的充分形成。(3)转mut1Ax1基因株系面筋样品中SS含量较转wt1Ax1基因株系(WT1Ax1-1)显着增加,表明Mut1Ax1中额外Cys残基参与了分子间二硫键的形成,进而加强了麦谷蛋白亚基分子间的相互作用。而其面筋蛋白二级构象random coil及β-turn向β-sheet的明显转换表明Mut1Ax1亚基更有利于面筋蛋白的有序折迭聚合。Mut1Ax1对面团加工品质特性的影响应归因于其中间重复区额外Cys残基参与形成分子间二硫键,增强亚基间交联度,有利于GMP聚合以形成更为致密的面筋网络,进而牢牢包埋淀粉及其它非可溶性颗粒,加强了面粉多组分间的充分互作,从而改善了面团品质。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
人工突变论文参考文献
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