间充质干细胞的成神经分化影响了其对肝细胞生长因子的趋化迁移效应

论文摘要

恶性胶质瘤是目前颅内最为常见的原发脑瘤，它具有极强的浸润和扩散的特性。目前，最常用的治疗手段无非外科手术切除和放疗或化疗的结合，但效果并不尽如人意，而干细胞移植极有希望治疗胶质瘤。因骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs）体内体外均显示很强的胶质瘤趋化性及可以向多种趋化因子（SDF、SCF、VEGF、HGF）迁移，并且具有多向分化潜能，所以应用BMSCs治疗胶质瘤即是很好的细胞治疗手段。本实验旨在研究肝细胞生长因子（HGF）对不同分化状态下BMSCs的迁移以及相关信号通路MAPK和PI3K/Akt的影响。并且，我们还进一步研究了HGF对不同分化状态下BMSCs的细胞骨架系统的变化以及磷酸化ERK1/2入核的情况。本研究首先采用Percoll密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离出BMSCs，体外扩增培养，通过观察细胞形态、生长特性，免疫荧光染色，成骨、成脂诱导分化，对BMSCs进行鉴定。结果显示，分离培养的BMSCs为长梭形，增殖速度快，表面抗原CD29、CD90、CD106呈阳性，CD34、CD45为阴性，并且体外能够诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞，证明分离培养的细胞是具有多向分化潜能的BMSCs。随后将传到3代以上的细胞作为纯度较高的BMSCs用作实验材料，以2×104/ml的密度接种于35mm2培养皿，培养皿中预先放置包被有0.05%多聚赖氨酸的盖玻片，待细胞贴壁后，通过丁羟基茴香醚（butyl hydroxy anisol, BHA）联合碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）诱导BMSCs成神经分化，即先用10ng/ml bFGF预诱导24h，再用200μM BHA和2%DMSO诱导5h，最后用含有N2的H-DMEM维持培养。观察该过程中细胞的形态变化，免疫细胞化学染色检测神经细胞特异性标志物nestin、β-III tubulin及MAP2的表达变化。结果显示，未分化BMSCs呈成纤维细胞样；预诱导24h后，胞体稍有收缩，边缘变得不齐整；诱导5h，胞体收缩成圆形或椭圆形，折光性强，有突起伸出；维持培养18h后，细胞出现3个或更多突起；维持培养48h，细胞突起更为复杂，出现二级分叉，突起长度增加，与其他细胞的突起相互接触。免疫荧光染色显示，nestin的表达在未分化间充质干细胞表达最高，随着成神经分化过程的进行逐渐降低。而β-III tubulin的表达在诱导5小时的细胞中开始出现，维持18小时和48小时阶段的细胞中有较弱的表达。整个分化过程中，MAP2都没有表达。接下来我们研究了不同分化状态下MSCs向HGF的迁移效应。我们首先利用Boyden chamber装置研究不同分化状态下BMSCs向不同浓度即0、5、25、50和100ng/ml的HGF的迁移，先对未分化BMSC进行迁移实验，发现HGF诱导的BMSCs的迁移呈现剂量依赖效应，HGF在50ng/ml时细胞达到最大迁移数量，为了研究这一种迁移是化学趋化性还是化学机动性引起的，我们将上室和下室均加入相同浓度的HGF发现与对照L-DMEM相比无明显差异，证实HGF诱导的迁移是化学趋化性引起的，接着我们对成神经分化的不同阶段细胞进行群体性迁移研究，结果发现，50ng/ml的HGF均能引起各个状态细胞明显的迁移，25ng/ml的HGF明显引起了诱导5h、维持18h和48h阶段细胞的迁移，我们也证实了这些分化阶段细胞的迁移仍是化学趋化引起的。另外，我们还研究了不同分化阶段细胞向同一浓度HGF迁移数量的比较，发现预诱导24h阶段的细胞向50ng/mlHGF迁移的数量更多，相比其他分化阶段有更明显的趋化效应。我们对迁移至膜下的细胞也进行了免疫荧光染色的鉴定，结果发现在所有的分化阶段，迁移至膜下的细胞中nestin阳性的细胞占绝大多数。并且HGF明显加强了nestin阳性细胞的迁移，而对β-III tubulin阳性的细胞没有明显作用。另外，与先前的结果一致的是，50ng/ml HGF明显加强了预诱导24小时阶段nestin阳性细胞的迁移。此外，我们还运用Dunn chamber装置研究了BMSCs及成神经分化不同状态下BMSCs向HGF的趋化性迁移，计算细胞迁移速率和迁移效率。结果显示，在趋化性迁移实验中，即外槽加入不同浓度HGF、内槽只加L-DMEM时，相比诱导5h、维持18h及48h，未分化及预诱导24h细胞的迁移速度呈现明显的加快。而当内外槽均加入50ng/ml HGF，细胞的迁移速率及迁移效率与对照相比无差异。另外，我们还研究了成神经分化各个阶段细胞的迁移速率，实验发现：当外槽都加入50ng/ml的HGF时，预诱导24h阶段的细胞相比其他分化阶段的细胞呈现出更高的迁移效率。MAPKs家族包括ERK1/2、p38MAPKs及SAPK/JNK，而Akt是PI3K信号通路的下游关键蛋白。已经有很多文献证实PI3K和MAPK信号通路参与体内诸多生化反应如细胞分裂、凋亡、分化及迁移。并且有文献报道HGF可以激活一些重要的信号通路分子，如ERK1/2、PI3K/Akt和p38MAPK。接下来我们应用蛋白印迹检测了HGF对不同分化状态下BMSCs中ERK1/2、Akt、p38MAPK及SAPK/JNK表达的影响。首先，我们用不同浓度的HGF处理未分化状态下的BMSCs，我们发现HGF诱导的ERK1/2、Akt和p38MAPK的磷酸化呈现浓度依赖效应。而HGF对SAPK/JNK的磷酸化没有影响。为了进一步研究HGF对两条信号通路的影响，我们选取了50ng/ml的HGF处理不同分化状态下BMSCs不同时间后，观察相关蛋白的磷酸化情况。结果发现，不同分化状态下的细胞均表达基底水平的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK，然而HGF所诱导的Akt的磷酸化的增加发生在未分化，预诱导24h和诱导5h阶段，并且这种磷酸化的增加从15分钟开始，一直持续到60分钟。在未分化和预诱导24小时状态的细胞中，HGF诱导的ERK1/2的磷酸化的增加从5分中开始，15分钟时达到峰值，而在30分钟内恢复到基底水平。而在诱导5小时、维持18小时和48小时的细胞中，这种增强的ERK1/2的磷酸化会持续到60分钟。对于p38MAPK的磷酸化，HGF刺激后，在未分化、预诱导24小时及诱导5小时的细胞中5分钟时开始增加，15分钟时达到峰值，而在维持18及48小时的细胞中却没有明显变化。HGF刺激不同分化状态的细胞后，SAPK/JNK增加的磷酸化发生在诱导5小时、维持18及48小时的细胞中。此外，我们也研究了五种状态的细胞中的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK基底水平的表达，结果发现，诱导5h和维持18h阶段磷酸化的ERK1/2明显高于其他阶段的细胞。而磷酸化的Akt在未分化的间充质干细胞中表达最高，随着细胞成神经分化的诱导，磷酸化的p38MAPK和SAPK/JNK的表达逐渐升高。最后，为了进一步证实HGF诱导的不同状态的细胞的迁移所参与的信号通路，我们引入了Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK信号分子的抑制剂LY294002、SB203580、PD98059和SP600125，即分别用四种信号分子的抑制剂预处理细胞后检测细胞向HGF的迁移情况。首先，利用Boyden chamber研究抑制剂预处理后细胞的群体迁移行为，发现PD98059阻断ERK1/2后明显的抑制了HGF诱导的所有状态细胞的迁移，特异阻断PI3K/Akt后，仅未分化阶段的细胞向HGF的迁移受到抑制，而分化阶段细胞的迁移没有受到明显抑制。当p38MAPK被阻抑后，只影响了未分化、预诱导24h和诱导5h阶段的细胞迁移，而SAPK/JNK被阻断后，维持18h和48h阶段的细胞迁移相应的受到了抑制。紧接着，我们又利用Dunnchamber装置进一步研究了抑制剂掺入后细胞在个体水平迁移速度和迁移效率的变化。结果发现，ERK1/2被抑制后，所有状态细胞的迁移速度及效率都受到了明显的抑制。抑制PI3K/Akt后明显抑制了未分化和预诱导24h阶段细胞的迁移速度及未分化、预诱导24h和诱导5h阶段细胞的迁移效率。阻断p38MAPK后，未分化、预诱导24h和诱导5h阶段的细胞迁移速度及迁移效率均明显降低。对于SAPK/JNK受到抑制后，诱导5h，维持18h和48h细胞的迁移速度及迁移效率都明显下降了。以上结果说明不同信号通路的分子在特定状态的细胞向HGF的迁移中发挥了重要的作用。细胞骨架的重组和细胞迁移是密切相关的。并且，当细胞所处环境存在趋化物时，细胞迁移需要极性的改变，并且细胞迁移的能力很大程度上取决于细胞骨架重组的能力。因此，我们也分析了HGF刺激后不同分化状态下BMSCs细胞骨架的重组。我们发现处于未分化及预诱导24小时阶段的细胞在HGF刺激0.5min时骨架便开始明显发生重组，细胞周边出现肌动蛋白聚集而形成的尾足；而在诱导5小时细胞中，细胞骨架的重组发生在HGF刺激后大约1min，在维持18h和48h阶段的细胞中，细胞骨架的重组发生在HGF刺激后大约1.5min，这说明随着分化的进行细胞骨架的重组对HGF的刺激敏感性下降。综上，HGF能够趋化不同分化状态下BMSCs的定向迁移，PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与介导了这些过程；成神经分化的BMSCs趋向HGF的迁移能力与其分化状态密切相关，不同的信号通路介导了不同分化状态的细胞向HGF的迁移。并且，HGF诱导的MSCs的细胞骨架的重组也与细胞的分化状态密切相关。本研究为进一步揭示BMSCs的定向迁移机制及临床应用BMSCs进行移植提供了理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 参考文献
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
• 1. 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 基本试剂
• 1.4 基本试剂的配制
• 2. 实验方法
• 2.1 BMSCs 的分离培养与扩增
• 2.2 BMSCs 形态学观察
• 2.3 BMSCs 的鉴定
• 3. 实验结果
• 3.1 BMSCs 的形态学观察
• 3.2 BMSCs 的鉴定
• 4.讨论
• 参考文献
• 第二部分 骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 基本试剂
• 1.3 基本试剂的配制
• 2.实验方法
• 2.1 BMSCs 成神经诱导
• 2.2 免疫荧光染色鉴定成神经分化
• 2.3 数据处理与统计学分析
• 3. 实验结果
• 3.1 BMSCs 成神经分化过程中的形态变化
• 3.2 免疫细胞化学鉴定 BMSCs 的成神经分化
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第三部分 HGF 对不同分化状态下 BMSCs 迁移及相关信号通路的影响
• 1. 实验材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 基本试剂
• 2. 实验方法
• 2.1 BMSCs 的培养及成神经诱导
• 2.2 Boyden chamber 研究 HGF 对不同分化状态下 BMSCs 迁移的影响
• 2.3 Dunn chamber 研究 HGF 对不同分化状态下 BMSCs 迁移的影响
• 2.4 Western blot 研究 HGF 刺激的信号通路 PI3K/Akt 和 MAPK 的变化
• 2.5 联合 Boyden chamber 和 Dunn chamber 进行的抑制剂实验
• 2.6 细胞迁移行为分析
• 2.7 数据处理与统计学分析
• 3. 实验结果
• 3.1 Boyden chamber 研究不同分化状态下 BMSCs 定向迁移
• 3.2 Dunn chamber 研究不同分化状态下 BMSCs 定向迁移
• 3.3 HGF 刺激不同分化状态下 BMSCs 后受体 c-Met 的变化
• 3.4 HGF 刺激不同分化状态下 BMSCs 后 PI3K/Akt 和 MAPKs 信号通路的变化
• 3.5 HGF 刺激不同分化状态下 BMSCs 中 p-ERK1/2 入核情况的研究
• 3.6 PI3K/Akt 和 MAPKs 信号通路参与调节了 HGF 诱导的不同分化状态下 BMSCs 的迁移
• 3.7 HGF 刺激不同分化状态下 BMSCs 中细胞骨架重组情况的研究
• 4. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 缩略词表 （Abbreviation）
• 本研究所获基金资助
• 致谢