抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究

论文摘要

甲胺磷（O,S-二甲基硫代磷酰胺）是一种剧毒的有机磷类农药,由于较好的杀虫效果往往被违禁使用,危害严重,有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点,在农药残留检测中具有突出的优势。目前虽有制备甲胺磷多克隆抗体和单克隆抗体的报道,但其抗体制备需进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备,周期长,成本高。第三代抗体—重组抗体的出现为快速、低成本制备小分子化学农药抗体提供了新的途径。为此,本论文开展了抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及抗甲胺磷单链抗体的表达与特性研究,主要研究内容及结果如下：1 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析利用活泼酯法将合成的甲胺磷半抗原β-（O,S-二甲基磷酰）氨基丙酸（HM3）与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联分别制备免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。将HM3-BSA按高（H）、中（M）、低（L）3个不同剂量组分别免疫Balb/c小鼠。抗血清分析结果表明,经过8次近6个月时间的免疫在高（H）剂量组中获得了1只良好免疫效果的H3号Balb/c小鼠。2抗体可变区基因的获得及抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建取H3号Balb/c免疫小鼠的脾细胞提取信使RNA（mRNA）,通过反转录PCR （RT-PCR）扩增出了大小约340bp和320bp的抗体重（VH）、轻链（VL）可变区基因片段。纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下,首先采用含有Linker接头片段的引物利用重叠延伸拼接法（SOE-PCR）将VH与VL基因片段组装成单链抗体（ScFv）基因片段,再用带有限制性内切酶位点的引物（5’端SfiⅠ,3’端NotⅠ）扩增含内切酶位点的ScFv基因,获得了大小约750bp的目的片段,纯化回收并分别用SfiⅠ和NotⅠ酶切消化后,与经SfiⅠ、NotⅠ双酶切过的噬菌粒载体pCANTAB5E连接,电转化大肠杆菌E.coli TG1,建成了库容约9.8×105的抗甲胺磷噬菌体单链抗体库。经对随机转化子质粒的PCR及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,该抗体库重组率高。BstNⅠ酶切图谱显示该噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。3抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定借助辅助噬菌体M13K07的超感染,扩建了滴度约1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌体-ScFv表面展示文库。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法,以包被原HM3-OVA对展示库进行了五轮“吸附、洗脱、扩增”的富集筛选,结果显示,从第三轮开始,噬菌体回收率、多克隆噬菌体ELISA的OD值及阳性率均呈现上升趋势。从第5轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量单克隆,经单克隆噬菌体ELISA及竞争ELISA进一步筛选鉴定,获得了6个特异性较强的抗甲胺磷噬菌体单链抗体阳性克隆,基因序列分析及Blast数据库检索表明所得6个阳性克隆的序列互不相同,均符合鼠源单链可变区抗体基因的结构和特征。4抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定将6个甲胺磷噬菌体阳性克隆提取噬菌粒分别转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌E.coli HB2151, IPTG诱导过夜小量制备各克隆的可溶性单链抗体。收集细菌沉淀及培养上清,采用渗透休克法提取菌体细胞周质中的可溶性单链抗体,并对培养上清进行超滤浓缩。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,周质腔提取物及浓缩上清在分子量约30KD处明显出现一增粗条带,与单链抗体的预期分子量相符,而阴性对照菌中没有该条带。间接ELISA结果显示,6个克隆的细菌培养上清和周质腔提取物中的抗体均能与包被抗原反应,说明分泌型单链抗体得到了正确的折叠和表达。间接竞争ELISA初步分析6个克隆新鲜制备的周质腔提取物对游离甲胺磷的竞争抑制性,结果显示,6个克隆的表达产物对游离甲胺磷均具有不同程度的抑制作用,其中克隆Met-93的周质腔提取物抑制中浓度I50值最高（887.66μg/mL）,克隆Met-28D4的周质腔提取物I50值最低（146.74μg/mL）。以抗体表达的最优化条件对Met-28D4阳性克隆株进行摇瓶发酵（1L）大量制备纯化单链抗体,抗体产量约0.98 mg/L培养基。以纯化单链抗体为免疫试剂,初步建立了甲胺磷竞争ELISA分析法。该ELISA标准曲线的线性范围为1～500μg/mL, I50为118.69μg/mL,检出限120为3.36μg/mL;在该线性范围内,标准曲线的批内和批间变异系数分别为2.3%和4.8%,稻谷和小白菜样品中添加甲胺磷后的平均回收率分别为83.8%和87.0%。交叉反应结果显示,本研究制备的纯化Met-28D4单链抗体仅与乙酰甲胺磷有部分交叉反应（4.9%）,而与供试的其它5种有机磷农药（敌敌畏、乐果、甲拌磷、甲基对硫磷和水胺硫磷）的交叉反应率均小于0.1%,表明所制备的纯化单链抗体对甲胺磷的识别是高度特异的。抗体稳定性试验结果表明,在蛋白保护剂存在条件下,4℃保存下的纯化单链抗体其结合活性可维持约6-7周的时间,基本能满足短期内单链抗体研究的需要,但在大规模生产、应用等方面,就显得稳定性不够。5抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定在巴斯德毕赤酵母P. pastoris （X-33）中分泌表达Met-28D4-ScFv。设计引物从Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上扩增Met-28D4-ScFv,亚克隆至P. pastoris表达载体pPICZαC,获得酵母表达质粒pPICZαC-ScFv。表达质粒pPICZαC-ScFv线形化后,电转化P.pastoris （X-33）。随机挑选转化子菌落进行PCR鉴定,结果显示,转化子的酵母染色体中均整合有外源ScFv基因。在抗性梯度筛选多拷贝整合菌株试验中,共获得5个在2000μg/mL ZeocinTM的YPDS选择平板上正常生长的菌落,表型鉴定结果均为甲醇利用快速型（Mut+）。对5个多拷贝Mut+型转化菌进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示,各菌株诱导48 h后在约30KD处均可见明显条带,72 h处表达量最大,各菌株表达量之间无明显差异；间接ELISA结果显示,各菌株诱导72h的表达产物具有较好的抗原结合活性。选其中一个稳定高表达的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株进行优化诱导表达试验,优化后的条件为：本实验室30℃、250 rpm的振荡培养条件下,菌体接种量OD600nm =1.5,培养基pH值6.5,每24 h补加甲醇至终浓度1.00%,诱导时间72 h。经过优化条件下的诱导表达,单链抗体的表达量达25 mg/L,比Invitrogen公司推荐的诱导表达条件下的表达量高5 mg/L。对优化条件下的诱导表达产物进行纯化并进行竞争ELISA初步试验,结果表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体与游离甲胺磷具有较好的抗原结合特异性,其I50为93.52μg/mL,与大肠杆菌表达的单链抗体的性质基本接近；交叉反应结果显示,酵母表达纯化单链抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.8%,与其它农药的交叉反应率均小于0.1%。稳定性试验表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体的稳定性比大肠杆菌表达的单链抗体的稳定性有了一定的提高。本论文研究结果为甲胺磷特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础,对开发其它小分子化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 噬菌体抗体库技术研究进展
• 1 噬菌体抗体库技术的基本原理
• 2 噬菌体展示技术载体系统的发展
• 2.1 丝状噬菌体展示系统
• 2.2 λ噬菌体展示系统
• 2.3 T4噬菌体展示系统
• 2.4 T7噬菌体展示系统
• 3 噬菌体抗体库的构建
• 3.1 抗体可变区基因的获得
• 3.2 噬菌体抗体库载体的构建
• 3.3 抗体可变区基因的表达
• 4 噬菌体抗体库的筛选
• 4.1 固相化或液相抗原筛选法
• 4.2 交替筛选法
• 4.3 双层膜筛选法
• 4.4 选择性感染噬菌体筛选系统
• 5 噬菌体抗体库的类型
• 5.1 天然抗体库
• 5.2 免疫抗体库
• 5.3 化学合成抗体库
• 6 噬菌体抗体库技术的特点与优势
• 7 噬菌体抗体库技术的应用
• 7.1 噬菌体抗体库技术在生物学、医学等领域的应用
• 7.2 噬菌体抗体库技术在农兽药等小分子化合物残留检测中的应用
• 8 噬菌体抗体库技术的应用前景及存在的问题
• 第二章 单链抗体及其表达系统研究进展
• 1 单链抗体的结构及特点
• 2 单链抗体的构建
• 3 单链抗体的应用
• 3.1 应用于基础理论研究
• 3.2 应用于放射性影像分析
• 3.3 构建免疫毒素应用于肿瘤治疗
• 3.4 应用于细胞内免疫
• 3.5 应用于构建双特异性抗体等其它基因工程抗体
• 3.6 应用于有害物质残留的检测
• 4 单链抗体表达系统
• 4.1 原核表达系统
• 4.2 真核表达系统
• 4.2.1 酵母表达系统
• 4.2.2 昆虫表达系统
• 4.2.3 植物表达系统
• 4.2.4 哺乳动物表达系统
• 4.3 噬菌体展示系统
• 5 单链抗体表达策略
• 6 单链抗体存在问题及改进方法
• 7 展望
• 第三章 农药小分子抗体制备及其免疫分析技术应用研究进展
• 1 农药多克隆抗体制备技术研究进展
• 2 农药单克隆抗体制备技术研究进展
• 3 农药重组抗体制备技术研究进展
• 3.1 从杂交瘤细胞系制备农药重组抗体
• 3.2 从抗体库中制备农药重组抗体
• 3.3 抗体特性体外改造制备农药重组抗体
• 3.4 农药重组抗体制备技术发展动态
• 4 人工模拟抗体制备农药抗体技术研究进展
• 4.1 传统抗体以外的蛋白来源抗体
• 4.2 核酸来源抗体
• 4.3 小分子物聚合材料抗体
• 5 农药免疫分析技术应用研究进展
• 5.1 酶免疫分析法
• 5.2 免疫分析芯片的应用
• 5.3 免疫试纸条的应用
• 6 问题与展望
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 技术路线图
• 第一章 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要溶液
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗原合成
• 1.2.2 免疫原的紫外可见光谱鉴定
• 1.2.3 小鼠免疫
• 1.2.4 间接非竞争ELISA测定抗血清效价
• 1.2.5 间接非竞争ELISA测定抗血清交叉吸附情况
• 1.2.6 抗原抗体工作浓度的初步确定
• 1.2.7 间接竞争ELISA初步测定抗血清识别甲胺磷的能力
• 2 结果与分析
• 2.1 免疫原的合成和鉴定
• 2.2 抗血清效价测定
• 2.3 交叉识别
• 2.4 间接竞争ELISA的抗原抗体工作浓度
• 2.5 间接竞争ELISA初步测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及噬菌粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基及溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 脾细胞的制备
• 1.2.2 总细胞RNA的提取
• 1.2.3 mRNA的纯化
• 1.2.4 第一链cDNA的合成
• 1.2.5 VH、VL基因的扩增
• 1.2.6 VH、VL基因的纯化回收及定量
• 1.2.7 ScFv基因的组装及扩增
• 1.2.8 ScFv基因的纯化回收及定量
• 1.2.9 ScFv的SfiⅠ和Not Ⅰ双酶切
• 1.2.10 与噬菌粒pCANTAB5E的连接
• 1.2.11 E.coli TG1电转感受态细胞的制备
• 1.2.12 大肠杆菌的电转化及库容量的测定
• 1.2.13 噬菌粒DNA的提取
• 1.2.14 转化子PCR及双酶切鉴定
• 1.2.15 抗体库多样性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的提取及鉴定
• 2.2 目的基因的扩增及鉴定
• 2.3 ScFv基因的连接与扩增
• 2.4 ScFv基因的克隆转化及库容量
• 2.5 转化子的PCR鉴定
• 2.6 转化子的双酶切鉴定
• 2.7 抗体库多样性分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、辅助噬菌体及单链抗体库
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基和溶液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 辅助噬菌体M13K07的大量制备
• 1.2.1.1 对数生长期E.coli TG1的制备
• 1.2.1.2 单个噬菌体原种M13K07病毒空斑的制备
• 1.2.1.3 辅助噬菌体M13K07的扩增
• 1.2.1.4 辅助噬菌体M13K07的滴度测定
• 1.2.2 原始scFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定
• 1.2.3 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选
• 1.2.3.1 第一轮富集筛选
• 1.2.3.2 次级噬菌体抗体库的制备和保存
• 1.2.3.3 次级ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定
• 1.2.3.4 进一步富集筛选
• 1.2.4 富集筛选效果的鉴定
• 1.2.4.1 多克隆噬菌体ELISA的初步鉴定
• 1.2.4.2 筛选菌落的PCR鉴定
• 1.2.4.3 重组噬菌粒的双酶切验证
• 1.2.4.4 单克隆噬菌体单链抗体的制备
• 1.2.4.5 单克隆噬菌体ELISA鉴定筛选效率
• 1.2.5 高亲和力阳性噬菌体抗体克隆的筛选
• 1.2.5.1 单克隆噬菌体ELISA筛选试验
• 1.2.5.2 竞争抑制试验
• 1.2.6 高亲合力阳性克隆ScFv基因序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 原始ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建
• 2.2 噬菌体单链抗体库的富集
• 2.3 富集筛选效果的分析鉴定
• 2.3.1 多克隆噬菌体ELISA的初步分析
• 2.3.2 筛选菌落的PCR鉴定
• 2.3.3 重组噬菌粒的双酶切验证
• 2.3.4 筛选效率的比较
• 2.4 单克隆噬菌体ELISA筛选高亲和力克隆
• 2.5 阳性噬菌体抗体克隆竞争抑制试验结果
• 2.6 阳性克隆单链抗体基因的序列分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基和缓冲液
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定
• 1.2.1.1 对数生长期E.coli HB2151的制备
• 1.2.1.2 阳性克隆重组噬菌体的制备
• 1.2.1.3 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染
• 1.2.1.4 ScFv的可溶性表达
• 1.2.1.5 不同表达部位产物的提取和浓缩
• 1.2.1.6 可溶性ScFv的SDS-PAGE检测
• 1.2.1.7 可溶性ScFv的间接ELISA检测
• 1.2.1.8 间接竞争ELISA初步分析
• 1.2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化
• 1.2.2.1 可溶性单链抗体的大量制备
• 1.2.2.2 纯化
• 1.2.3 竞争ELISA分析方法的初步建立
• 1.2.3.1 纯化抗体的效价测定
• 1.2.3.2 抗原抗体工作浓度的测定
• 1.2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价
• 1.2.3.4 抗体特异性考察
• 1.2.3.5 精确度试验
• 1.2.3.6 添加回收试验
• 1.2.4 单链抗体稳定性试验
• 2 结果与分析
• 2.1 可溶性单链抗体的小量制备及鉴定
• 2.1.1 阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染
• 2.1.2 ScFv的可溶性表达及检测
• 2.1.2.1 SDS-PAGE检测
• 2.1.2.2 间接ELISA检测
• 2.1.2.3 间接竞争ELISA分析
• 2.2 可溶性单链抗体的大量制备和纯化
• 2.3 纯化抗体ELISA标准曲线的建立及评价
• 2.3.1 纯化抗体的效价
• 2.3.2 抗原和抗体的工作浓度
• 2.3.3 ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价
• 2.3.4 抗体特异性考察
• 2.3.5 精确度试验
• 2.3.6 准确度试验（添加回收）
• 2.4 单链抗体的稳定性
• 3 讨论
• 3.1 关于Met-ScFv可溶性抗体的表达
• 3.2 关于单链抗体的纯化
• 3.3 关于本研究中单链抗体结合特性的分析
• 3.4 关于Met-ScFv可溶性单链抗体的亲和性和特异性
• 3.5 关于单链抗体的稳定性
• 3.6 关于单链抗体在农药酶联免疫分析上的应用前景
• 4 小结
• 第五章 抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 PCR引物
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 培养基和溶液
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酵母表达质粒pPICZα C的制备
• 1.2.1.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 1.2.1.2 pPICZα C质粒的转化和质粒菌的扩增培养
• 1.2.1.3 pPICZα C质粒的提取和定量
• 1.2.1.4 pPICZα C质粒的单酶切鉴定
• 1.2.1.5 pPICZα C质粒菌的保存
• 1.2.2 酵母表达载体pPICZα C-ScFv质粒的构建
• 1.2.2.1 阳性克隆菌的扩增培养
• 1.2.2.2 质粒PCANTAB5E-ScFv的提取
• 1.2.2.3 含内切酶位点的目的基因ScFv的扩增、回收及定量
• 1.2.2.4 目的片段的双酶切、回收及定量
• 1.2.2.5 pPICZα C质粒的双酶切、回收及定量
• 1.2.2.6 目的片段ScFv与pPICZα C的连接、转化
• 1.2.2.7 转化子的PCR鉴定及酶切验证
• 1.2.2.8 阳性克隆的保存
• 1.2.3 表达载体pPICZα C-ScFv与酵母基因的整合
• 1.2.3.1 重组表达质粒pPICZα C-ScFv的大量提取及定量
• 1.2.3.2 质粒pPICZα C的大量提取及定量
• 1.2.3.3 pPICZα C和重组质粒pPICZα C-ScFv的线形化与纯化浓缩
• 1.2.3.4 感受态酵母细胞的制备
• 1.2.3.5 酵母菌株的电转化
• 1.2.4 菌落PCR检测目的基因整合
• +型转化子的筛选'>1.2.5 多拷贝Mut⁺型转化子的筛选
• 1.2.5.1 多拷贝转化子的筛选
• 1.2.5.2 多拷贝菌株生长表型的鉴定
• 1.2.6 高表达阳性克隆的筛选
• 1.2.6.1 阳性克隆菌的诱导表达
• 1.2.6.2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 1.2.6.3 表达产物的ELISA分析
• 1.2.7 酵母表达条件的初步优化
• 1.2.7.1 诱导表达时间优化
• 1.2.7.2 不同菌体密度的诱导表达
• 1.2.7.3 不同pH培养液的诱导表达
• 1.2.7.4 不同剂量甲醇的诱导表达
• 1.2.8 优化条件下的大量表达
• 1.2.9 目的蛋白浓缩纯化
• 1.2.10 酵母表达单链抗体免疫特性初步分析
• 1.2.10.1 抗原抗体工作浓度确定
• 1.2.10.2 间接竞争抑制试验
• 1.2.10.3 抗体特异性测定
• 1.2.11 酵母表达单链抗体稳定性试验
• 1.2.11.1 表达产物4℃保存条件下的稳定性试验
• 1.2.11.2 遗传稳定性检测
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒pPICZα C-ScFv的构建及鉴定
• 2.2 重组质粒转化毕赤酵母菌X-33及鉴定
• +型转化子的筛选结果'>2.3 多拷贝Mut⁺型转化子的筛选结果
• +型转化子的原始诱导表达及鉴定'>2.4 多拷贝Mut⁺型转化子的原始诱导表达及鉴定
• 2.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.4.2 表达产物的ELISA鉴定及最佳诱导时间
• 2.5 酵母表达条件的初步优化
• 2.5.1 最佳诱导菌体密度
• 2.5.2 最佳诱导pH值
• 2.5.3 最佳诱导甲醇剂量
• 2.6 抗体的优化表达及纯化
• 2.7 酵母表达单链抗体化学免疫特性初步分析
• 2.7.1 抗原和抗体的工作浓度
• 2.7.2 酵母表达抗甲胺磷单链抗体抑制曲线
• 2.7.3 抗体特异性考察
• 2.8 酵母表达单链抗体的稳定性
• 2.8.1 4℃保存条件下的稳定性
• 2.8.2 遗传稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 总结、创新点及展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文