大熊猫Ⅱ类MHC功能基因的分离及适应性进化研究

论文摘要

主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex,MHC）是脊椎动物所特有的多基因家族,能编码种类丰富的细胞表面糖蛋白,具有呈递抗原、启动免疫应答的功能,是动物适应性免疫系统的重要组成部分。哺乳动物Ⅱ类MHC包括DRA、DRB、DQA和DQB等多个经典基因,编码呈递细菌类外源性抗原分子;Ⅱ类MHC基因的exon2编码抗原结合部位,具有高度的多态性,与物种抵抗病原体的能力及对复杂环境的适应性直接相关。本研究以大熊猫指名亚种的“卧龙种群”、“成都种群”和秦岭亚种的“佛坪-楼观台种群”共121只个体为对象,通过对功能性Ⅱ类MHC经典座位的分离和遗传变异分析,揭示了大熊猫Ⅱ类MHC基因多样性的维持机制及其与免疫相关的适应性进化特性。主要的研究结果如下:1)首创了磁珠富集杂交cDNA分离MHC基因的方法。该方法简单、快速、高效。本文运用这一方法分离获得了7个Ⅱ类MHC基因,共10条全长cDNA。该结果不仅重复获得了文献所报道的“大熊猫Ⅱ类MHC基因组计划”已确认的6个表达的经典座位,还新发现和克隆了一个新的座位DRB3,从而表明了所建方法的有效性。2)本文分离获得的10条大熊猫Ⅱ类MHC基因的全长cDNA（DRA 1条,DRB1 2条,DRB3 1条,DQA1 2条,DQA2 1条,DQB1 2条,DQB2 1条）均可以编码完整的蛋白质序列。因此,目前已发现的大熊猫具有功能的经典Ⅱ类MHC基因,包括DRA、DRB1、DRB3、DQA1、DQA2、DQB1和DQB2等7个。3)在以大熊猫“卧龙种群”、“成都种群”和“佛坪-楼观台种群”的121只个体为对象,并利用座位特异性的PCR-SSCP基因分型和测序方法进行6个Ⅱ类MHC功能基因的遗传变异检测中,共克隆了25条等位基因。其结果,发现DRA和DQB2均为单态,而其余4个座位则是中度多态的（6条DRB3等位基因、7条DQA1等位基因、4条DQA2等位基因、6条DQB1等位基因）。与其他濒危的哺乳动物相比,大熊猫的适应性免疫系统（Ⅱ类MHC）具有更丰富的基因多样性。4)在大熊猫的人工圈养种群中,“卧龙种群”和“成都种群”具有相同的等位基因数目,但其分布频率差别明显。进一步的分析发现,“卧龙种群”存在着明显的奠基者效应,其种群中的优势等位基因被主要奠基者携带的等位基因所统治。鉴此,基于维持圈养大熊猫的遗传多样性及提高大熊猫的疾病抵抗能力的必要性,本文建议应加强该种群携带稀有等位基因之大熊猫个体的繁殖成功率。5)大熊猫指名亚种和秦岭亚种在多态的Ⅱ类MHC基因中,具有明显的等位基因丰度差异。其中,指名亚种在DQ区比秦岭亚种具有更多的等位基因（16:10）,但秦岭亚种在DR区的等位基因数又多于指名亚种（11:9）。与此同时,在DQ区和DR区,指名亚种和秦岭亚种分别具有9条和5条各自所特有的等位基因。上述结果,充分表明了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在其亚种分化之后,各自经历了独立的进化历史,并进化产生了适应不同环境的亚种特异性Ⅱ类MHC基因。6)在大熊猫Ⅱ类MHC基因中,存在着多个方面的平衡选择证据:a.基因的观察杂合度明显高于期望杂合度;b.各基因抗原结合位点的氨基酸杂合度显著地高于非抗原结合位点（P＜0.01）;c.抗原结合位点的选择参数ω值（dN/dS,即非同义置换率与同义置换率之比）显著地高于非抗原结合位点ω值（P＜0.01）;d.5个多态性的座位共存在44个受正选择压力的氨基酸位点,其中95.45%位于抗原结合位点及其附近。这些平衡选择证据,充分表明了Ⅱ类MHC基因在大熊猫的适应性进化过程中,发挥了重要作用。7)大熊猫指名亚种在DRB1和DQA2座位上的选择参数ω值均小于1,属于净化选择模式,表明了净化选择在指名亚种的DRB1和DQA2基因中,是处于统治地位的。相反地,秦岭亚种的选择参数ω值在7个表达的Ⅱ类MHC基因中均大于1,属于正选择模式,表明了正选择广泛地存在于秦岭亚种的Ⅱ类MHC基因中。该结果,明晰地揭示了大熊猫指名亚种和秦岭亚种在Ⅱ类MHC基因的进化机制上,存在着驱动因素的差异。8)无论是大熊猫的指名亚种还是秦岭亚种,在新发现的DRB3座位上,都具有极大的ω值（抗原结合位点的ω值均大于9.27;非抗原结合位点的ω值均大于4.39）,表明了DRB3新座位的抗原呈递结构域在其漫长的进化过程中,经历了有别于其它哺乳动物之极强的正选择作用。此外,两亚种的DRA和DQB2基因均为单态,表明了大熊猫的DRA和DQB2基因在其进化过程中,历经的进化选择模式,为极强的净化选择作用。而两亚种在DRB1、DQA1和DQB1三个座位中,出现了基因内的重组现象,表明了重组事件是大熊猫Ⅱ类MHC等位基因多样性的产生机制之一。综上所述,大熊猫Ⅱ类MHC基因的多样性,是由自然选择和基因内重组等动力因素共同驱动来维持的,也就是说“平衡选择、正选择、净化选择和基因内重组,是大熊猫在适应性进化过程中维持其Ⅱ类MHC基因组多态性的主要进化动力”。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 目次
• 第一部分 绪论
• 第1章 大熊猫研究综述
• 1.1 大熊猫的分类与生存现状
• 1.2 大熊猫保护遗传学的研究现状
• 1.2.1 保护遗传学的概念
• 1.2.2 大熊猫的非损伤取样和DNA提取
• 1.2.3 大熊猫保护遗传学研究
• 第2章 主要组织相容性复合体（MHC）及其应用
• 2.1 MHC的分类和结构
• 2.2 MHC基因的多态性维持机制
• 2.3 MHC在保护遗传学中的应用
• 第3章 立论依据、研究内容和目的
• 第二部分 研究内容
• 第4章 磁珠富集杂交cDNA方法的建立及Aime-MHC基因分离
• 4.1 材料
• 4.1.1 样品来源
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器和设备
• 4.2 实验方法和步骤
• 4.2.1 血液总RNA的提取
• 4.2.2 第一链全长cDNA的合成及扩增
• 4.2.2.1 第一链全长cDNA的合成
• 4.2.2.2 第一链全长cDNA的PCR扩增
• 4.2.3 MHC基因生物素化探针的标记
• 4.2.3.1 生物素化探针的PCR标记
• 4.2.3.2 生物素化探针标记效率的检测及探针的纯化
• 4.2.4 磁珠富集杂交
• 4.2.4.1 生物素化MHC基因DNA探针与全长cDNA的杂交
• 4.2.4.2 磁珠富集
• 4.2.4.3 杂交洗脱液的PCR丰富
• 4.2.5 MHC cDNA的克隆及测序
• 4.2.5.1 洗脱液DNA的纯化
• 4.2.5.2 回收片段的转化
• 4.2.5.3 全长cDNA的筛选
• 4.2.5.4 全长cDNA的测序
• 4.2.6 数据处理
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 大熊猫血液cDNA的PCR扩增结果
• 4.3.2 大熊猫Ⅱ类MHC基因生物素化探针的标记结果
• 4.3.3 杂交产物的PCR丰富及回收
• 4.3.4 大熊猫Ⅱ类MHC基因cDNA克隆的结果
• 4.3.4.1 大熊猫DRA基因cDNA克隆的结果
• 4.3.4.2 大熊猫DRB基因cDNA克隆的结果
• 4.3.4.3 大熊猫DQA基因cDNA克隆的结果
• 4.3.4.4 大熊猫DQB基因cDNA克隆的结果
• 4.3.5 大熊猫Ⅱ类MHC功能基因的鉴定及全长cDNA序列分析
• 4.3.5.1 大熊猫Ⅱ类MHC功能基因
• 4.3.5.2 磁珠富集杂交cDNA分离MHC基因的效率
• 4.3.5.3 大熊猫DRA基因全长cDNA的序列分析
• 4.3.5.4 大熊猫DRB基因全长cDNA的序列分析
• 4.3.5.5 大熊猫DQA基因全长cDNA的序列分析
• 4.3.5.6 大熊猫DQB基因全长cDNA的序列分析
• 4.4 小结
• 第5章 大熊猫DRB3部分基因组序列的克隆
• 5.1 材料
• 5.1.1 样品来源
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器和设备
• 5.2 实验方法和步骤
• 5.2.1 血液基因组DNA的提取
• 5.2.2 DRB3内含子的扩增
• 5.2.2.1 DRB3 intron1的LA-PCR扩增
• 5.2.2.2 分段扩增DRB3 intron1及克隆测序
• 5.2.2.3 DRB3部分intron2序列的扩增
• 5.2.3 DRB3 intron1和intron2扩增终产物的连接、克隆和测序
• 5.2.4 数据处理
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 大熊猫DRB3基因内含子的扩增及克隆
• 5.3.2 DRB3座位基因组序列分析
• 5.4 小结
• 第6章 大熊猫Ⅱ类MHC功能基因的适应性进化研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 样品来源
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要仪器和设备
• 6.2 实验方法和步骤
• 6.2.1 基因组DNA的提取和纯化
• 6.2.1.1 血液基因组DNA的提取
• 6.2.1.2 血棉和皮张基因组DNA的提取
• 6.2.1.3 粪便基因组DNA的提取
• 6.2.2 座位特异性PCR-SSCP基因分型
• 6.2.2.1 座位特异性引物的设计
• 6.2.2.2 大熊猫Ⅱ类MHC基因exon2的座位特异性PCR
• 6.2.2.3 大熊猫Ⅱ类MHC基因exon2种群变异的SSCP分析
• 6.2.3 数据处理
• 6.2.3.1 序列比对和分析
• 6.2.3.2 哈-温平衡和杂合度的检测
• 6.2.3.3 MHC基因内重组的检测
• 6.2.3.4 存在重组情况下估算正选择作用
• 6.3 结果
• 6.3.1 大熊猫基因组DNA的提取结果
• 6.3.2 大熊猫种群Ⅱ类MHC基因的PCR-SSCP结果
• 6.3.2.1 大熊猫种群DRA基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.2.2 大熊猫种群DRB3基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.2.3 大熊猫种群DQA1基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.2.4 大熊猫种群DQA2基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.2.5 大熊猫种群DQB1基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.2.6 大熊猫种群DQB2基因exon2的PCR扩增及SSCP结果
• 6.3.3 大熊猫Ⅱ类MHC基因的遗传多样性
• 6.3.3.1 大熊猫MHC基因的等位基因、分布频率及杂合度
• 6.3.3.2 大熊猫MHC基因的序列变异和氨基酸杂合度
• 6.3.3.3 大熊猫MHC基因的重组、正选择及净化选择
• 6.4 讨论
• 6.4.1 大熊猫MHC基因的等位基因丰度及单态性
• 6.4.2 大熊猫MHC基因的多态性水平
• 6.4.3 亚种内及亚种间等位基因分布的差异
• 6.4.4 大熊猫亚种间MHC基因的正选择和净化选择差异
• 6.4.5 大熊猫MHC基因的平衡选择和基因内重组
• 6.5 小结
• 第三部分 结论
• 第7章 主要结论、创新点及展望
• 7.1 本研究的主要结论
• 7.2 本研究的创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 作者简历及博士期间的科研成果