猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法的建立及病毒分子流行病学研究

论文摘要

猪瘟又称经典猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）,是由猪瘟病毒（Classical swine feverviruS,CSFV）引起猪的高度致死性、接触性传染病。本研究建立了CSFV E2 RT-PCR检测方法,并采用该方法进行了CSFV在人工感染实验猪体内的组织分布研究,同时对我国部分地区进行了CSFV分子流行病学研究。为了建立一种准确灵敏特异的CSFV RT-PCR检测方法,并根据目的产物的序列进行CSFV的分子流行病学研究,分析CSFV的分子遗传进化趋势。本研究通过比对GenBank公布的34条国内外已测得的CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病病毒-Ⅰ（BVDV-Ⅰ）和6条BVDV-Ⅱ基因组全序列,避开与BVDV同源区域,在CSFV基因组E2区域设计并合成了4对引物,标记为F1-R1、F2-R1、F3-R1、F4-R2:以CSFV石门株血毒为标准模板对引物进行筛选,然后对RT-PCR反应体系各成分进行优化,建立了一套CSFV RT-PCR检测方法。采用研制的三批CSFV RT-PCR试剂,通过对30个质控样品进行特异性、灵敏度、敏感性、稳定性和重复性验证后,证明该反应体系对FMDV/C220、PPV09/79、PRRSV/BJ、BVDV-OregonC24、BVDV-NADL、PRV-BJ/99、PCV-2/71等7种其他病原不能检出;灵敏度可达到8.9pg/uL病毒RNA;重复检出率分别在91.11%-100%;同时采用欧盟猪瘟参考实验室20份标准样品进行符合性试验,符合率达到90%,表现出高度的一致性。结果显示该方法具有良好的特异性、灵敏度、敏感性、稳定性和重复性。为了全面系统的研究猪瘟病毒感染后在猪体内外的病毒分布规律,指导流行病学调查采样,本研究通过肌肉注射人工感染毒价为4×103.84TCID50/ml的CSFV石门株血毒,造成16头60日龄长白猪急性感染模型,同时设立1头阴性对照。人工感染后每天随机选择两头猪,腋动脉放血致死,采集各组织器官和体外排泄分泌物共34种,采用上述建立的CSFV RT-PCR检测方法对34种急性样品进行CSFV核酸检测,并用抗CSFV E2单抗WH303对其中22种组织器官进行免疫组化检测抗原;同时进行临床观察、体温测定并给予进行临床计分。RT-PCR检测结果显示,感染后第一天有7种组织器官CSFV检测为阳性,至第五天34种急性样品全部检测为阳性,整个感染病程中血液的CSFV核酸检出数最多,检出率93.7%（15/16）;其次是各种与免疫相关的淋巴结和淋巴样组织,而肌肉和皮肤检出数最少;4种体外样品（粪、尿、眼分泌物、鼻拭子）分别在3-5天内检出阳性。免疫组化检测结果显示,22种组织器官切片中有19种观察到阳性信号,这19个组织器官与CSFV RT-PCR检测结果相符合:而皮肤、肌肉和喉头的组织切片中未观察到阳性信号。结果表明在CSFV人工急性感染模型中,病毒感染后能在24小时间内出现病毒血症,持续整个急性感染病程;病毒对血液和与免疫相关的组织器官表现出更高的亲和性,并且在3-5天内开始出现体外排毒;CSFV RT-PCR和免疫组化两种方法在急性感染模型的检测中具有较高的符合性,符合率为86.36%。上述研究对CSFV临床诊断具有重要的指导意义,临床急性感染猪应首先采集血液和免疫器官,其次为空肠、回肠段等组织器官。但是在对感染猪只进行处理时必须严格控制对感染猪胴体的处理,以防止疾病扩散。运用本研究所建立的CSFV RT-PCR对我国18省市644份疑似猪瘟样品进行检测,再将检测为阳性的样品序列进行分析,以研究国内猪瘟流行态势和地理分布。结果644份疑似样品中检出CSFV阳性74份,测回序列73条;经过DNAStar分析,发现73株流行株分别为基因1.1（50.68%）、2.1（42.47%）、2.2（5.48%）等3个亚群,与HCLV核苷酸同源性在75.7%-100%之间与SM核苷酸同源性在74.3%-100%之间,流行株推导氨基酸序列与HCLV和SM株氨基酸序列同源性均在85.5%-100%之间;73株野毒以“北京、天津、河北——湖北——广东”轴乐西发散式分布在我国中东部地区;研究显示目前无基因3群流行株存在。本研究成功建立了CSFV RT-PCR检测方法,为CSFV的临床诊断提供了重要的技术支持,临床应用显示本研究所建立的方法也可以用于CSF流行态势的监测;同时通过对急性感染的研究得到人工感染模型中病毒的组织分布和排毒规律,为进一步研究CSFV的致病机理增添了新的数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 CSFV病原学及分子生物学特征
• 1.2 CSFV的致病机理
• 1.3 CSFV的检测
• 1.4 CSFV的流行
• 1.5 CSF的综合防控
• 第2章 引言
• 1 研究目的和研究意义
• 2 研究内容和技术路线
• 第3章 CSFV RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第4章 CSFV人工急性感染后在体内外分布规律研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第5章 我国部分地区猪瘟病毒分子流行病学调查
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第6章 结论与创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在校期间发表文章