论文摘要
硫化矿物的氧化产生酸性矿坑水（acid mine drainage, AMD），酸性矿坑水呈酸性，通常含有高浓度的铁、铝、硅以及重金属离子如铜、锌、砷、金、银、铅、钙等。因此，酸性矿坑水能引起严重的水体污染。酸性矿坑水中的微生物可以大大地加速硫化矿物的氧化，而其中某些微生物可以从酸性矿坑水中筛选出来并用来进行生物浸出。酸性矿坑水的地理化学特性随着地点、时间的改变而改变，而微生物群落的组成可以反映这种变化。为了更好地了解酸性矿坑水和酸性矿坑水中微生物群落的组成、为了更好的进行酸性矿坑水的治理以及为浸矿细菌的筛选提供理论指导，我们从湖北大冶铜绿山矿采集了酸性矿坑水，对其中的微生物群落组成进行了分析。铜绿山矿山是列入联合国世界文化遗产目录的矿山，坐落于中国湖北省大冶市。该矿山是一座从商代晚期就开始开采的古铜矿，距今已有3000多年的历史。铜绿山矿系岩浆期后矽卡岩型铜铁矿床，铜和铁是铜绿山矿山的主要元素，孔雀石是铜绿山矿山的主要矿物，假孔雀石、辉铜矿、赤铜矿的含量也很丰富。在铜绿山矿，共收集了三个样地（tls1，tls2，tls3）的酸性矿坑水以及样地tls2酸性矿坑水下的底泥。在铜绿山矿，当地农民利用铜绿山某废弃铜矿井进行生物浸出，浸出液通过交换池时与铁屑发生置换反应，铜被置换出后酸性矿坑水被排出。tls1酸性矿坑水取自此交换池排水口，为发生置换反应后的酸性矿坑水，酸性矿坑水呈黄色。tls2酸性矿坑水取自铜绿山另一废弃多年的铜矿井的地面积水，酸性矿坑水呈绿色，同时采集了酸性矿坑水下的底泥；此矿井与tls1酸性矿坑水取样矿井相距0.5km，。tls3酸性矿坑水取自铜绿山仍在开采的矿井的循环水排水口，酸性矿坑水呈微黄色；此矿井与商代古矿井遗址相距仅约1km。采集后的水样通过真空滤膜进行真空抽滤，得到的滤泥保存在-20℃并用于微生物群落多样性的分析；部分水样送至中南大学测试中心进行全元素分析用于揭示样地的物理化学性质。本研究使用聚合酶链式反应-限制性酶切片断长度多态性（PCR-RFLP）技术和16S rDNA克隆文库重建技术来分析酸性矿坑水以及底泥中的微生物群落组成及其差异性；同时对样地的地理化学特性进行检测，并与微生物群落组成结合起来共同揭示物理化学性质对酸性矿坑水以及酸性矿坑水中微生物群落组成的影响。首先，利用土壤DNA提取方法提取酸性矿坑水滤泥以及底泥的基因组，并将基因组进行纯化。其次，利用细菌通用引物63F（5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’）及1387R（5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’）和古菌通用引物S-D-Arch-0344-a-S-20（5′-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3′）及S-*-Univ-1517-a-A-21（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）对纯化后的基因组进行PCR扩增，并将扩增到的产物进行纯化。然后，将纯化后的PCR产物连接到载体上并克隆到大肠杆菌感受态细胞中。然后，通过蓝白筛选挑取阳性克隆子，在99.9℃对阳性克隆子进行破壁，利用载体引物对其进行PCR扩增。然后，在37℃利用DNA限制性内切酶HinP1Ⅰ和MspⅠ对得到的阳性克隆子的PCR产物进行双酶切，酶切时间为4-5个小时。酶切后，将酶切后的产物于80V、3％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳，分析凝胶电泳图中的电泳条带的差异。分析后，选取特异性凝胶电泳条带所对应的克隆子，并将克隆子进行测序列测定。最后，将得到的序列与已知序列进行比对，并进行系统发育树的构建，同时结合样地物理化学性质对酸性矿坑水及底泥中的微生物群落组成及差异性进行分析。样地的地理化学特性结果显示tls1和tsl2酸性矿坑水中的离子浓度较高，其中tls1中的铁元素的含量较高，tls2中的铜元素的含量较高，两样地的pH值均较低，分别为2.1和2.3，；tls3中的离子浓度较低，pH值较高，为5.4。样地的地理化学特性的主要成份分析（PCA）显示tls1和tsl2的地理化学特性比较相似，而tls3与前两者的地理化学特性相差较大；三样地间的pH、铜、亚铁、全铁的含量有较大的差异，其余元素含量差异不大。限制性酶切片断长度多态性分析显示，tls1、tls2、tls3三个样地的细菌16S rDNA克隆文库中分别只有14、11、19种操作分类单元（OTUs，即RFLP条带类型）；tls2古菌16S rDNA克隆文库中有6种操作分类单元；tls2的酸性矿坑水下的底泥中的细菌16S rDNA克隆文库中有12种操作分类单元。共测定了62个克隆子的序列，这些序列与当前数据库（GenBank）中已有序列的相似性在89％-99％之间。将测定得到的序列与某些已知细菌序列进行行系统发育树的构建。系统发育分析显示，tls1中酸性矿坑水中细菌组成主要为A. ferrooxidans和Leptospirillum，这两者分别占tls1酸性矿坑水中细菌群落组成的37.5％和22.7％。tls2酸性矿坑水中细菌组成主要为A. ferrooxidans和Leptospirillum，这两者分别占tls2酸性矿坑水中细菌群落组成的36.3％和40.7％；tls2酸性矿坑水中古菌组成主要为Thermoplasma属古菌，占tls2酸性矿坑水中古菌群落组成的73.0％。tls2酸性矿坑水下底泥的微生物群落组成分析显示，其主要微生物组成为Acidiphilum和与类似Methylocella的细菌，两者分别占tls2底泥中细菌群落组成的52.1％和13.7％。tls3酸性矿坑水中细菌组成主要为一些属于alpha-Proteobacteria的细菌，占tls3底泥中细菌群落组成的46.1％。系统发育分析同样揭示了三样地酸性矿坑水的微生物群落组成的差异性。对三个样地酸性矿坑水中细菌序列构建系统发育树，结果显示，tls1和tls2中的克隆子序列主要与gamma-Proteobacteria中的A. ferrooxidans以及Nitrospira中的Leptospirillum相关；而tls3中的克隆子序列主要分布于alpha-Proteobacteria和gamma-Proteobacteria（其中无克隆子与A. ferrooxidans相关）中。基于gamma-Proteobacteria, alpha-Proteobacteria, Nitrospira, Acidobacteria, Actinobacteria和delta-proteobacterium六大类基础上的主要成份分析显示，tls1和tls2的酸性矿坑水有着相似微生物群落组成，而tls3的微生物群落组成与前两者相差较大。结合地理化学特性的主要成份分析、系统发育分析以及微生物分类基础上的主要成份分析，我们可以发现样地属性相似的tls1和tls2两地的酸性矿坑水中的微生物群落组成相似，而与前两者样地属性相差较大的tls3的微生物群落组成与前两者相差也较大。总之，通过分析湖北大冶铜绿山酸性矿坑水以及底泥的微生物群落多样性，我们发现本研究中酸性矿坑水的微生物群落多样性很低；酸性矿坑水中的微生物多与已知的浸矿微生物相关；底泥与酸性矿坑水的微生物群落组成相差很大；样地地理化学属性相近的酸性矿坑水中的微生物群落组成相似。
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标签：多样性论文; 微生物群落论文; 样地地理化学属性论文; 系统发育树论文; 酸性矿坑水论文;