论文摘要
随着科学技术的进步,射线、微波、电磁辐射等在人类的生活越来越普及,例如医疗诊断、特殊造影、医用治疗以及商用辐照等。然而科学技术的进步也给人类社会带来了许多负面影响,其中最重要的是人类健康问题。辐射线对人类的健康造成了严重的威胁,许多人已经注意到它对机体遗传物质的损伤。世界各国对射线、微波、电磁辐射等都有规范的,统一的评价程序,其中最常用的是染色体畸变（CA）分析和微核实验（MNT）。CA分析的优点在于结果精确,可靠,能够提供的信息比较丰富,但费时费力,需要进行细胞培养。传统的微核实验（MNT）已满足不了实际工作的需要,依然依赖于人工显微镜计数,主观性太强;一般要求计数数千个细胞,工作量太大且敏感性较低,并能导致一些样本的漏检或出现一些假阳性。发展微核的自动化检测就成为快速监测人群遗传损伤的重要手段。近年来随着流式细胞仪检测技术不断的改进与完善,国内外很多专家、学者均致力于自动化试验的研究。1992年瑞典科学家Grawe发展了一种流式仪小鼠外周血网织红细胞微核自动检测技术,1993年我室曹佳发展并改进了这一技术,使其达到了实用化水平。2003年,我室孙立平建立基于单激光流式细胞仪的大鼠骨髓嗜多染红细胞微核的自动化检测体系;并结合磁式细胞分离技术,成功应用于人鼻咽癌（NPC）放疗患者外周血网织红细胞微核率的检测,初步尝试将该方法作为估算累积辐射剂量的生物计量仪使用。本研究是在我室前期工作基础上,以小鼠为动物模型,建立了低剂量X射线诱导小鼠骨髓红细胞微核率流式细胞仪自动化检测方法。随后,利用该方法结合新近发展的磁式细胞分离技术,观察头面部癌症患者接受低剂量X射线治疗后外周血网织红细胞微核率的动态变化。研究所得主要结果如下:1、流式细胞仪检测低剂量X射线辐照后小鼠骨髓fMNPCE与fMNNCE:经过对不同的检测参数的分析比较,最终确定以FL1（指示DNA荧光强度）为纵坐标,FSC（指示细胞大小）为横坐标能够很好地区分各个细胞群——总有核细胞（TNC）、嗜多染红细胞（PCE）、含微核的嗜多染红细胞（MNPCE）、正染红细胞（NCE）以及含微核的正染红细胞（MNNCE）。经X射线处理20小时后,一次辐照剂量0.05Gy、0.1Gy和0.4Gy,小鼠骨随fMNPCE分别是3.01±0.55‰、4.58±±0.83‰和11.12±1.72‰;对于不同的累积剂量0.1Gy、0.15 Gy、0.2 Gy、0.3Gy、0.4Gy、0.8Gy、1.2Gy和1.6Gy,小鼠骨髓fMNPCE分别为4.72±0.95‰、10.26±2.09‰、13.77±1.66‰、11.77±2.33‰、17.71±2.19‰、16. 43±1.33‰、21.85±3. 25‰以及22.17±3.48‰;结果显示出良好的剂量-反应以及时间-效应关系。2、流式细胞仪检测结果与人工镜检结果的比较:两种方法检测的结果均呈现良好的剂量-反应以及时间-效应关系,但流式仪检测结果略高于人工镜检结果,统计分析显示两种方法检测的结果之间没有显著差异,并且二者之间具有良好的相关性（R=0.984,P < 0.01）。3、磁式细胞分选术分离富集效果:共对7例健康志愿者及7例头面部癌症患者在接受不同累积放疗剂量后的外周血中的CD71抗原阳性的网织红细胞（Trf-Ret）进行了富集分离,结果表明,不同个体间Trf-Ret的产量差异很大,在20%-90%之间,但这并非分离方法所致,而是个体差异造成,如年龄,工作以及接受辐射线剂量大小等。并证实该方法具有简单、可靠,重复性好的特点。4、流式细胞仪检测低剂量X射线辐照后人外周血MN-Trf-Ret:以FL4 （指示RNA荧光）为纵坐标,FSC（指示细胞大小）为横坐标,将富集后人外周血样本分成明显的5个细胞群———网织红细胞、含微核的网织红细胞、成熟红细胞、含微核的成熟红细胞和有核细胞,利用流式细胞仪成功检测了头面部癌症患者接受低剂量X射线辐照前后外周血MN-Trf-Ret的变化。结果显示,头面部癌症患者接受放疗后fMN-Trf-Ret快速显著增高,随着累积放疗剂量的继续增加,fMN-Trf-Ret一直处于高平台水平。对应于不同的累积放疗剂量0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy以及10Gy,fMN-Trf-Ret的平均值分别为2.89±0.93‰、16.2±2.31‰、23.84±3.22‰、32.17±6.95‰、30.89±9.35‰以及35.74±9.95‰。5、低剂量X射线辐照的曲线拟合方程:在已获得的fMN-Trf-Ret与累计放疗剂量的量效以及时效反应关系基础上,经SPSS13.0拟合的最佳曲线方程为Y=2.595+8.874X-1.005X2+0.044X3（R=0.978, P<0.05）,初步研究认为在0Gy-10Gy剂量范围内,可尝试利用该方程对辐射事故中的辐射伤员的受照生物剂量进行评估和进一步验证。综上所述,本实验成功利用流式细胞仪检测了小鼠在低剂量X射线全身辐照后,观察到骨髓红细胞微核率的变化趋势;并将其用来观察人在接受低剂量X射线辐照前后外周血网织红细胞微核率变化情况。结果表明流式细胞仪自动化检测法在低剂量X射线具有敏感、快速、简便的特点,为微核流式细胞仪自动化检测推广及应用打下了基础。
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