论文摘要
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus，KSHV）是新近发现的人类疱疹病毒，又称为人疱疹病毒8型（Human herpesvirus 8，HHV-8）。流行病学研究证实该病毒是卡波氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS）、原发性渗出性淋巴瘤（Primary effusion lynphoma，PEL）及多中心卡氏病（Mμlticentre cattleman’s disease，MCD）的病原体。由于卡波氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS）是AIDS患者中最常见的肿瘤，也高发于器官移植术后，因而作为KS病原体的KSHV的研究日益受到重视。我国KSHV感染情况的研究以新疆维吾尔自治区为主，其KSHV感染率及KS发病率均较高，而我国其他省份报道不多。利用Hirt DNA提取法，从KSHV潜伏感染细胞系BCBL-1中提取病毒DNA作为模板，通过特异引物PCR获得病毒基因orf65及orf73。分别构建至原核表达载体，利用大肠杆菌表达系统表达His融合的病毒蛋白ORF65及ORF73羧基端多肽。通过Ni亲和层析及电洗脱方法，我们获得纯化的ORF65蛋白及ORF73羧基端多肽用于开展以纯化ORF65为抗原的的酶联免疫吸附（ELISA）、免疫印记（western-blot）实验，以ORF73羧基端多肽为抗原的酶联免疫吸附实验（EHSA），结合以细胞BCBL-1为抗原的间接免疫荧光（IFA）实验，检测自2007年1月至2007年5月采集于湖北省高中学生的396份血浆样本，并进行统计学分析。实验发现，KSHV抗体阳性率为4.8％。不同性别间抗体阳性率差异无显著性。为后续实验需要，我们以原核表达并纯化的ORF73羧基端免疫大白兔，制备了多克隆抗体。该抗体可以识别原核表达的ORF73羧基端多肽，BCBL-1细胞核提取物中的病毒全长ORF73／LANA蛋白。在以BCBL-1细胞为抗原的IFA中能使细胞核着染典型的点状荧光。类似于其他的疱疹病毒，KSHV的生活史包含了裂解期与潜伏期。KSHV的潜伏感染与细胞转化、肿瘤形成密切相关。目前用于治疗KSHV感染的药物主要针对病毒DNA多聚酶，能有效抑制病毒裂解复制，但无法清除潜伏病毒。本文探讨了病毒蛋白潜伏期相关核抗原（Latency associated nuclear antigen，LANA）为药物筛选靶标的可行性。我们合成了潜伏病毒中籍以结合LANA的LANA结合位点（LBS）DNA，经退火得到双链LBS。将LBS插入载体序列中，利用同尾酶的特性，使插入载体的LBS数目不断累积，直至插入64个串联排列的LBS序列。经电泳迁移率变换实验（EMSA）验证，原核表达系统表达并纯化的LANA羧基端多肽可以同合成的LBS结合，这种结合是特异性的。将含有串联多聚LANA结合位点DNA（LBS）的质粒转染潜伏感染KSHV的细胞系BCBL-1，连续观察取样，以Hirt技术提取样品中的病毒DNA，通过荧光定量PCR（quantative PCR，qPCR）及常规PCR技术检测细胞中病毒附加体数目的变化。实验发现，串联重复LBS通过竞争结合LANA，抑制LANA蛋白与病毒DNA的结合，阻断LABIA功能的正常发挥，能够减少潜伏于宿主细胞的病毒附加体。这为以LANA为靶点的药物筛选提供了理论基础。在此基础上，我们构建了以病毒潜伏期相关核抗原（LANA）为靶标的高通量药物筛选模型。将原核表达并经纯化的LANA羧基端多肽吸附于96孔酶标板，通过比较加入药物与未加药物时，生物素标记的LBS与LANA的结合情况来判定药物的有效性。生物素标记的LBS与LANA的结合情况可以通过加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链酶亲和素及底物邻苯二氨（OPD）-过氧化氢（H2O2）产生的显色反应强度予以检测。
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标签：卡波氏肉瘤相关疱疹病毒论文; 血清流行病学论文; 潜伏期相关核抗原论文; 结合位点论文; 抗病毒药物筛选模型论文;