德昌松毛虫细胞培养及昆虫细胞库管理系统的设计与实现

论文摘要

昆虫细胞培养技术是近年来迅速发展起来的细胞工程中的主要领域之一,广泛应用于医学、农业及生物学的各个方面。本文以鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae）松毛虫属（Dendrolimus Germer）的德昌松毛虫（Dendrolimus punctatus tehchangensis Tsai）为试验材料,对其血淋巴细胞、卵巢组织、胚以及新孵幼虫组织进行了体外培养试验。同时,研究开发了适合昆虫细胞库管理的计算机管理系统,为实现昆虫细胞库长期规范有效的管理奠定了基础。主要试验结果如下:1、德昌松毛虫组织的细胞培养本研究摸索了德昌松毛虫组织体外培养的各种条件,得出一套针对其各种组织的适宜的培养方法,并使细胞在体外增殖并存活较长时间。（1）培养基:通过对比发现,Grace、MGM-450、MM、TNM-FH等4种昆虫培养基均适用于德昌松毛虫血淋巴细胞、卵巢细胞、胚细胞以及新孵幼虫细胞的培养。（2）德昌松毛虫幼虫血淋巴细胞培养:采用静置法收集血淋巴细胞,将初始密度控制在0.27×106～0.53×106个/mL之间可取得较好培养效果。培养的细胞由圆形悬浮生长型、圆形贴壁生长型、梭形贴壁生长型、多边形贴壁生长型细胞以及网状结构细胞等5种不同类型的细胞组成。通过换液培养,松毛虫血淋巴细胞可在体外存活1年以上。（3）德昌松毛虫蛹卵巢细胞培养:选取卵巢管端丝和生殖区部分（长约5mm）,使用胰蛋白酶消化和机械剪切相结合的方法离散组织能取得较好的培养效果。培养物由圆形悬浮生长型、圆形贴壁生长型,以及多边形贴壁生长型等3种不同类型细胞组成。通过换液培养,卵巢细胞可在体外最长存活1年以上,并传代3次。（4）德昌松毛虫胚和新孵幼虫细胞培养:通过筛选发现,胰蛋白酶消化法适用于德昌松毛虫胚的组织离散处理,得到圆形悬浮生长型、圆形贴壁生长型,以及梭形贴壁生长型3种不同类型细胞。通过换液培养,胚细胞在体外已存活8个月以上,并传代2次;新孵幼虫组织使用酶消化法处理后有圆形悬浮生长型细胞从组织块迁出。通过换液培养发现,新孵幼虫细胞在体外增殖缓慢,不易进行传代培养。对比后发现,蛹卵巢和胚组织细胞更易于培养且有可能获得连续增殖的细胞系。2、昆虫细胞库管理系统的设计与实现针对目前昆虫细胞库日常维护工作中在数据和资料管理方面存在的不足,使用Microsoft Visual Basic 2005软件开发工具与Microsoft SQL Server 2005数据库管理系统等工具构建了一套昆虫细胞库管理系统,分为两大子功能系统,10个功能模块。（1）细胞冻存与复苏档案管理子系统:通过4个功能模块实现对细胞冻存与复苏操作的全程监控,能够实现数据的添加、修改、删除、检索、统计,并实现对细胞复苏操作定时提醒等功能。（2）细胞档案管理子系统:通过6个功能模块实现对各细胞系相关数据,包括图片、文档、资料,以及各种实验数据的统一管理及保存,并可对数据进行添加、修改、删除、导出等相关操作。系统具有功能全面、操作简洁、方便实用等特点,大大提高了细胞库的管理水平,为昆虫细胞库的长期有效管理奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究的目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 昆虫细胞工程国内外研究现状与发展趋势
• 1.2.1 昆虫细胞体外培养技术研究进展
• 1.2.2 昆虫细胞的应用研究进展及发展趋势
• 1.3 实验室信息管理系统（LIMS）的研究现状与发展趋势
• 1.3.1 LIMS 的研究进展
• 1.3.2 我国LIMS 的研究进展
• 1.3.3 细胞库相关LIMS 的研究进展
• 1.3.4 LIMS 发展趋势
• 1.4 研究目标和主要研究内容
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 主要研究内容
• 1.5 研究技术路线
• 1.5.1 德昌松毛虫组织细胞培养研究技术路线
• 1.5.2 昆虫细胞库管理系统设计与实现技术路线
• 第二章 德昌松毛虫幼虫血淋巴细胞培养
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试虫
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 耗材
• 2.1.4 主要试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试剂的配制
• 2.2.2 原代培养方法
• 2.2.3 细胞形态学研究方法
• 2.2.4 传代培养方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 德昌松毛虫幼虫血淋巴细胞原代培养结果
• 2.3.2 德昌松毛虫幼虫血淋巴细胞传代培养结果
• 2.4 结果小结
• 2.5 讨论
• 第三章 德昌松毛虫蛹卵巢细胞培养
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试虫
• 3.1.2 试验试剂
• 3.1.3 耗材
• 3.1.4 主要试验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 试剂的配制
• 3.2.2 原代培养方法
• 3.2.3 细胞形态学研究方法
• 3.2.4 传代培养方法
• 3.2.5 传代培养悬浮生长型细胞生长曲线的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 德昌松毛虫蛹卵巢细胞原代培养结果
• 3.3.2 德昌松毛虫蛹卵巢细胞传代培养结果
• 3.4 结果小结
• 3.5 讨论
• 第四章 德昌松毛虫胚和新孵幼虫细胞培养
• 4.1 试验材料、试剂和主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 原代培养方法
• 4.2.2 德昌松毛虫胚和新孵幼虫细胞形态学研究方法
• 4.2.3 德昌松毛虫胚和新孵幼虫细胞传代培养方法
• 4.2.4 细胞生长曲线的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 德昌松毛虫胚和新孵幼虫细胞原代培养结果
• 4.3.2 德昌松毛虫胚细胞传代培养结果
• 4.4 结果小结
• 4.5 讨论
• 第五章 昆虫细胞库管理系统的设计与实现
• 5.1 开发方案
• 5.1.1 系统实现目标
• 5.1.2 数据库的建立
• 5.1.3 系统功能结构及模块的划分
• 5.2 开发工具及数据库软件的选择
• 5.3 软件系统实现技术要点
• 5.3.1 数据库访问技术
• 5.3.2 面向组件的开发模式
• 5.4 昆虫细胞库管理系统的功能
• 5.4.1 直观的“细胞冻存结构视图”
• 5.4.2 及时的细胞复苏提醒功能
• 5.4.3 细胞图片管理系统
• 5.4.4 细胞核型分析系统
• 5.4.5 生长曲线分析系统
• 5.5 小结
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.1.1 德昌松毛虫组织细胞体外培养研究结果
• 6.1.2 昆虫细胞库管理系统设计与实现结果
• 6.2 讨论
• 6.2.1 细胞生长状态观点在昆虫细胞培养研究中的应用
• 6.2.2 德昌松毛虫组织细胞培养研究的展望
• 6.2.3 对昆虫细胞库管理系统未来构架的探讨
• 参考文献
• 在读期间的学术研究
• 致谢