海带“单倍体十号”cDNA文库构建及EST序列分析

论文摘要

海带是一种重要的大型经济海藻,我国海带养殖面积、养殖产量均居世界首位。海带可作为食品、化工原料、心血管药物等,在国民经济和人民生活中发挥着不可替代的作用。海带生物量巨大,是太平洋和大西洋暖温带海域潮下带的重要初级生产力,其与生活的海洋环境形成了具有高生物多样性和高生产力的生态系统。海带生活史中典型的异型世代交替现象以及孤雌生殖和无配生殖现象,也使之成为藻类学和遗传学研究的良好模型生物。海带富含多糖和酚类物质、染色体数目众多（2n=44）、且基因组巨大（434Mb720Mb）,为海带的分子遗传学研究带来了诸多的难题。迄今为止,海带基因及新型分子标记研究工作进展极为缓慢。目前,已公布的EST（Expressed Sequence Tags）数量仅为3496条,可以直接应用于遗传性状研究的SSR标记尚未见报道。本研究以海带“单倍体十号”（雌性配子体克隆）为实验材料,构建了其cDNA文库,并对文库进行了EST测序和生物信息学分析。得到主要实验结果如下:（1）对分别采用改良的异硫氰酸胍法、Trizol法以及Total RNA提取试剂盒法三种方法提取的总RNA,进行紫外吸收检测和电泳检测。结果表明三种方法均可获得完整的海带配子体克隆总RNA,尤以改良的异硫氢酸胍法提取的总RNA质量最好。（2）通过磁珠法从总RNA中分离得到mRNA,使用cDNA synthesis kit（Stratagene）经过一系列反应合成双链cDNA,通过QIAquick gel extraction kit（QIAGEN）胶回收大于500bp的片段,连接到载体PBluescriptⅡSK（+）,转染宿主菌DH10B E.coli,构建了cDNA文库,获得了1.31×106个原始克隆,重组率为87%。（3）以cDNA文库为基础,进行随机测序,得到1478个ESTs。去除载体序列、低质量序列后剩余大于100bp的有效序列为805个。这些ESTs拼接出的叠联群（contigs）有76个,单拷贝EST（singlets）有321个,做blastx和NCBI非冗余蛋白库比对,叠联群和单拷贝EST共有119个比对上,占30%。做blastn和NCBI非冗余核酸库比对,叠联群和单拷贝EST共有52个比对上,占13.1%。在两个数据库中同时能检索到的序列有42个。与dbEST中的海带属（Laminaria）ESTs比对,共有58个叠联群和单拷贝EST比对上,占14.6%。对与非冗余蛋白库比对上的119个contigs和singlets做GO分类（Gene Ontology）,109个可以在细胞组分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和生物学过程（Biological Processs）三个大类中得到分类,而其余10个contigs和singlets则为未能分类的序列。本实验所获取的EST序列,为海带基因组学研究提供了最为直接的基础信息,同时也为海带遗传学研究和应用实践奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 海带生物学特征及概述
• 1.1.1 海带分类及自然分布
• 1.1.2 海带的外部形态
• 1.1.3 海带的繁殖习性及生活史
• 1.2 海带配子体克隆技术及其应用
• 1.2.1 海带配子体克隆的建立
• 1.2.2 海带配子体克隆的应用
• 1.3 基因文库
• 1.3.1 基因组文库和cDNA 文库
• 1.3.2 cDNA 文库的载体系统
• 1.3.3 cDNA 文库的类型
• 1.3.4 cDNA 文库的作用
• 1.4 EST 技术及其应用
• 1.4.1 EST 技术发展概述
• 1.4.2 EST 技术的原理
• 1.4.3 EST 技术的应用
• 1.4.4 藻类表达序列标记研究的进展
• 1.5 生物信息学的产生和应用
• 1.5.1 生物信息学产生的背景
• 1.5.2 生物信息学的应用
• 2 海带“单倍体十号”cDNA 文库构建
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂、仪器及其相关处理
• 2.2.1 试剂配制
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 提取RNA 实验用具及相关处理
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 海带配子体总RNA 的提取
• 2.3.2 分离纯化mRNA
• 2.3.3 cDNA 文库的构建
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 总RNA 质量检测
• 2.4.2 mRNA 质量检测
• 2.4.3 cDNA 文库质量检测
• 3 EST 序列测定及分析
• 3.1 实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒的提取
• 3.2.2 测序PCR 反应及纯化
• 3.2.3 测序
• 3.2.4 生物信息学分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验结果
• 3.3.2 讨论与分析
• 4 今后研究方向
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文