大肠杆菌高密度发酵中的热力学分析与应用

论文摘要

本研究论文以制定适合本实验室构建的重组大肠杆菌最优发酵温度为目的，以热力学方法为手段，结合分批-补料培养的发酵放大工艺，对大肠杆菌生长期和诱导期的控制温度策略、发酵表达产物中出现多聚体的原因进行了探讨。论文的研究工作为获得工程菌最优发酵工艺温度参数开辟了新的途径，对高密度发酵中出现目标蛋白多聚体的原因进行了论证。通过本研究，得到了大肠杆菌的生长放热曲线，从热力学的角度分别建立了适合大肠杆菌生长期和诱导期的热力学模型。通过对模型参数建立非线性方程，得到了生长期比生长速率与温度的关系，又分析得到了诱导期的最佳诱导温度，得到了最佳培养温度，从而得到了大肠杆菌分批-补料发酵的最优温度控制策略。在生长期，有dPt／dt=μPt-γPt2对于大肠杆菌BL 21 3.1，比生长速率与温度的非线形方程为：μ=-0.0001T2+0.0057T2-0.1596T+1.4598Topt=34.1896℃对于大肠杆菌BL 21 3.7，比生长速率与温度的非线形方程为：μ=-0.0001T3+0.0053T2-0.1491T+1.3654Topt=34.3952℃在诱导期，本文给出一个线性方程用来描述其生长发热曲线。线性模型如下：dPt／dt=μPt+m验证表明，模型与实验数据吻合良好。结论：以提高胶原蛋白发酵表达产量为目的，对BL 21 3.1生长期34.2℃培养，诱导期42℃温度诱导，对BL 21 3.7生长期34.4℃培养，诱导期42℃温度诱导。把本文得出的温度控制策略在发酵罐上进行分批-补料发酵，分析研究了发酵中出现二聚体的原因。结论：胶原蛋白高表达是发生聚合的前提。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 热力学概述
• 1.1.1 生物体系自组织现象的非平衡态热力学解释
• 1.1.2 生物体的耗散结构理论
• 1.1.3 生命科学中代谢过程的热化学及热动力学研究方法——微热量热法
• 1.1.3.1 微生物生长热谱的测定
• 1.1.3.2 微量量热法对细菌的研究概况
• 1.1.3.3 微生物不同类型代谢的力能学参数测定
• 1.1.4 生物热分析在生命系统生理过程研究中的应用
• 1.2 胶原蛋白
• 1.2.1 胶原蛋白概述
• 1.2.2 胶原蛋白的组成和结构
• 1.2.3 胶原蛋白的理化性质
• 1.2.4 类人胶原蛋白的优越性
• 1.3 高密度发酵及其影响因素
• 1.3.1 底物因素
• 1.3.2 生长抑制物因素
• 1.3.3 溶氧浓度因素
• 1.3.4 温度因素
• 1.3.5 pH值因素
• 1.4 本研究的目的、意义及内容
• 1.4.1 目的与意义
• 1.4.2 实验方案及目的
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 活化培养基
• 2.1.2.2 保藏培养基
• 2.1.2.3 种子培养基
• 2.1.2.4 发酵和补料培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微热量热法
• 2.2.2 培养方法
• 2.2.2.1 摇瓶培养
• 2.2.2.2 分批-补料培养
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 微热量热分析
• 2.3.2 细胞生长的测定
• 2.3.3 细胞干重的测定
• 2.3.4 葡萄糖浓度的测定
• 2.3.5 NH2-R的测定
• 2.3.6 总蛋白含量的测定
• 2.3.7 类人胶原蛋白的测定
• 2.3.7.1 定性测定
• 2.3.7.2 定量测定
• 第三章 大肠杆菌高密度发酵中的热力学分析与应用
• 3.1 微热量热实验
• 3.2 模型的建立及热力学分析应用
• 3.2.1 模型的建立
• 3.2.1.1 Logistic模型
• 3.2.1.2 线形模型
• 3.2.2 热力学分析应用
• 3.3 动力学模型误差分析
• 3.4 发酵最优控制温度的确定
• 3.4.1 发酵前期最佳温度的确定
• 3.4.2 发酵后期诱导温度的确定
• 3.5 本章小结
• 第四章 最优控制温度下高密度分批-补料发酵表达胶原蛋白
• 4.1 胶原蛋白蛋白表达量
• 4.1.1 获得胶原蛋白的实验流程
• 4.1.2 胶原蛋白的定量分析
• 4.2 胶原蛋白多聚体的表达与分析
• 4.3 本章小结
• 附录
• 参考文献
• 致谢