论文摘要
目的:研究HIV-1和SIV nef基因表达对T淋巴细胞系的细胞功能及蛋白谱的作用,以探寻Nef促进HIV致病性增强的细胞内分子作用靶点。方法:构建pAd-HIV-1 nef-EGFP和pAd-SIVmac239 nef-EGFP重组腺病毒质粒,并利用HEK293T细胞将之包装和扩增为含有目的基因的腺病毒,并检测病毒滴度,以感染T淋巴细胞系,使其表达目的蛋白。设四个实验组,正常MT-2细胞即Control组和单独表达EGFP空载体的Ad-EGFP组,表达HIV-1 nef蛋白的Ad-HIV-1 nef-EGFP组和表达SIVmac239蛋白的Ad-SIVmac239 nef-EGFP组。通过流式细胞仪和荧光显微镜检测重组腺病毒的感染率;通过Western blotting证实HIV-1和SIV nef蛋白的表达;检测HIV-1和SIV nef基因表达对T淋巴细胞系细胞增殖和细胞周期的影响,及其对细胞表面分子CD4,CXCR4,HLA-I和HLA-DR表达的影响。制备四个实验组的MT-2细胞总蛋白,利用固相PH梯度（Immobilized pHgradient,IPG）双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis,2-DE）分别对四组细胞的总蛋白进行分离,进行考马斯亮蓝染色,扫描图像并获取蛋白质双向电泳凝胶图谱。应用ImageMaster 2D Elite 5.0分析软件进行凝胶图像分析,寻找Ad-HIV-1 nef-EGFP和Ad-SIVmac239 nef-EGFP两组间差异表达的蛋白质。切取较明显表达的蛋白质点,通过胶内酶切,点样,应用基质辅助电离解析飞行时间质谱（Matrix-assitsted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）获得蛋白质的肽质量指纹图谱（Peptide mass fingerprint,PMF）,再通过MALDI-TOF/TOF-MS串级质谱对蛋白质进行序列分析,得到蛋白质二级质谱图。利用Mascot软件搜索IPI Human database蛋白质数据库,将获得的肽段信息进行对比分析,明确是何种蛋白质。结果:成功构建Ad-HIV-1 nef-EOFP和Ad-SIVmac239 nef-EGFP重组腺病毒质粒;利用HEK 293T细胞对表达目的基因的腺病毒分别包装和扩增,检测病毒滴度分别为:pAd-EGFP组:3.56×106活性单位/mL（IU/mL）,pAd-HIV-1 nef-EGFP组:5.40×106活性单位/mL（IU/mL）,pAd-SIVmac239nef-EGFP组:5.62×106活性单位/mL（IU/mL）;依照重组腺病毒的滴度,对重组腺病毒进行梯度稀释感染目的细胞并进行感染效率测定,得出以下重组腺病毒的MOI值可使感染目的细胞的效率达到95%以上。本研究的实验均按照此MOI值。pAd-EGFP:17.8 IU/cell,pAd-HIV-1 nef-EGFP:27 IU/cell,pAd-SIVmac239 nef-EGFP:28.1 IU/cell。Western blotting检测证实了HIV-1和SIV nef基因在T淋巴细胞系MT-2细胞内的表达;HIV-1和SIV nef基因表达可促进MT-2细胞和C8166细胞的增殖,并使处于DNA合成期和分裂期的细胞比率增多;HIV-1和SIVmac239 Nef蛋白表达均可下调MT-2细胞表面的CD4,CXCR4,HLA-I和HLA-DR分子,其中,SIVmac239 Nef蛋白下调CD4,CXCR4和HLA-I类分子的作用要强于HIV-1 Nef蛋白。比较分析Ad-HIV-1 nef-EGFP组和Ad-SIVmac239 nef-EGFP组两组间的双向电泳图谱,其蛋白点数分别为1002和949,匹配点为876,匹配率为89.9%。找出8个差异表达的蛋白质点,其中4个蛋白表达差异点可能与HIV致病性相关,proteasome 26S non-ATPase subunit 13 isoform 2在Ad-SIVmac239 nef-EGFP组不表达,可能与其对蛋白酶体的调节及感染SIV的T细胞活化水平较低有关,HIV-1Nef有可能在进化中丢失了这一功能而导致T活化水平升高;CMPK cytidylatekinase在Ad-HIV-1 nef-EGFP组表达可能与促进HIV复制有关;TPT1 tumorprotein,translationally-controlled 1在Ad-SIVmac239 nef-EGFP组不表达,而在Ad-HIV-1 nef-EGFP表达增加,STRAP Serine-threonine kinase receptor-associatedprotein在Ad-SIVmac239 nef-EGFP组表达下调,这两个蛋白可能与感染HIV的T细胞增殖水平升高有关。结论:本研究成功构建Ad-HIV-1 nef-EGFP和Ad-SIVmac239 nef-EGFP重组腺病毒质粒,并证实其在T淋巴细胞系细胞中的表达具有与HIV和SIV病毒的Nef蛋白相同的功能。比较蛋白质组学的方法分析表明表达HIV-1和SIV nef基因的MT-2细胞中有四个差异表达的蛋白可能与HIV致病性相关,且均为进化过程中的高度保守蛋白。在从SIV演变和跨种传播过程中,HIV-1 Nef可能具有了选择性作用于宿主体内的某些保守蛋白的功能而导致宿主对HIV复制支持性增强。而这些保守蛋白有可能作为药物靶点来干预HIV在宿主体内的复制力和感染力,从而降低HIV在宿主体内的致病性。