水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22和酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与功能分析

论文摘要

在本实验室前期研究中，证明了苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）能诱导水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等病害的系统抗病性，并在此基础上运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA。同源性搜索发现，其中一个差别表达克隆BIHN-n22含有623bp的插入片段，该插入片断编码的蛋白与植物中ankyrin（锚蛋白）类型蛋白具有高度相似性。进一步搜索发现GenBank数据库中的水稻cDNA序列发现有一个长度为1529 bp的差别表达cDNA克隆J023125M12，（GenBank accession NO．AK121370）和一个1475by的cDNA克隆J013000M21（GenBank accession NO．AK098858）（Kikuchi，S et al.,2003），它们与本序列的相似性都达到99％，与植物中ankyrin（锚蛋白）类型蛋白具有高度相似性。为研究探讨这个可能的锚蛋白基因的生物学功能以及在水稻抗病性中的作用，我们以这个已知序列设计引物，我们以前期构建好的水稻全长cDNA文库为模板克隆了这个基因，并命名为OsBIHN-N22。OsBIHN-N22基因编码蛋白由329个氨基酸组成，含有3个保守的ANK重复。这个蛋白属于ANK家族。细胞定位分析表明这个蛋白定位在细胞膜上。对其基因结构分析表明OsBIHN-N22基因包含八个外显子和七个内含子。Southern杂交表明OsBIHN-N22基因在水稻基因组中以单拷贝的形式存在于水稻的第九条染色体上。通过对OsBIHN-N22基因在水稻中的特异性表达分析发现，OsBIHN-N22能被苯并噻二唑（BTH）诱导表达，并且在BTH处理后的24h达到很高水平，在随后的60h内一直维持在相当高的水平上。而在水处理的对照中发现OsBIHN-N22的表达水平在整个实验检测时期都较低。在BTH处理的水稻幼苗中，OsBIHN-N22基因的表达在受到稻瘟病菌M.grisea侵染后被快速激活。稻瘟病菌接种后0h即可检测到OsBIHN-N22基因的激活表达，而且在随后的18h内强度增加，并在48h内维持在一个相当高的水平上。在没有BTH处理，只有稻瘟病菌接种的水稻叶片中直到6h才有诱导表达，然后在18h内可以检测到比较明显的表达水平，随后迅速降低。在水稻与稻瘟病菌的非亲和性互作中，OsBIHN-N22基因在接种后的6h就能检测到其快速表达，而在亲和性互作中则只有在36h才有微弱的表达。在与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA中，另外一个长度为1897bp的差别表达克隆002-112-H10（GenBank accession NO．AK106615）。这个克隆与植物中的AMPBP（AMP-binding protein）蛋白家族中的酯酰辅酶A合成酶类（acyl-CoA Synthetases）有高度的相似性。我们以该cDNA克隆的已知序列设计了一对特异性引物，从水稻的cDNA文库中通过PCR扩增到这个序列，并把这个基因命名为OsBNHN-N7。OsBNHN-N7基因编码一个含有558个氨基酸的蛋白，分子量为60.4kD，等电点为7.87，含有一个Caic（Acyl-CoA synthetases（AMP-forming）／AMP-acid ligasesⅡ）结构域。Southern杂交显示OsBNHN-N7基因以多拷贝的形式存在于水稻基因组内。通过细胞定位实验也证明OsBNHN-N7编码蛋白定位在细胞质膜上。Northern杂交表明OsBNHN-N7基因在BTH处理后的24小时后有一个很高的表达水平；而在水处理的对照中只有较低的本底表达水平。另外我们在研究中发现在BTH处理的水稻幼苗在受到M.grisea侵染后，OsBNHN-N7基因在接种后的6小时就被快速的激活表达，其后表达水平继续增强并持续稳定一个高水平上。在水处理的对照中，稻瘟病菌接种后36小时内只有很微弱的低水平诱导表达。在利用水稻的一对近等位基因系H8R和H8S研究与稻瘟病菌的亲和与非亲和性互作中发现，与H8R的非亲和性互作中，OsBNHN-N7基因能被快速激活表达，而与H8S的亲和性互作中，只有极微弱的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述与研究背景
• 1.1 植物抗病过程中涉及的信号传导途径
• 1.1.1 植物与病原菌互作过程中由R-Avr介导的信号传导途径
• 1.1.2 植物诱导抗病性中的信号途径
• 1.1.2.1 依赖于水杨酸（SA）的抗性途径
• 1.1.2.2 茉莉酸,乙烯介导的信号途径
• 1.2 锚蛋白的研究现状
• 1.2.1 锚蛋白的结构和异型结构体
• 1.2.1.1 锚蛋白结构
• 1.2.1.2 锚蛋白异形体
• 1.2.2 锚蛋白相互作用蛋白
• 1.2.2.1 与细胞骨架蛋白相互作用的锚蛋白
• 1.2.2.2 锚蛋白与膜蛋白的互相作用
• 1.2.3 锚蛋白重复序列（ankyrin repeat,ANK repeat）
• 1.3 植物中的锚蛋白
• 1.3.1 与植物生长、发育相关的锚蛋白
• 1.3.2 参与植物抗逆性的锚蛋白
• 1.3.3 参与植物抗病性的锚蛋白
• 1.3.3.1 NPR1-SA信号途径中的关键基因
• 1.3.3.2 ACD6-拟南芥中典型的ankyrin-repeat蛋白
• 1.3.3.3 与植物抗病性有关的其它锚蛋白
• 1.3.4 拟南芥中的AtAnkTM基因家族
• 1.4 AMP-binding protein家族
• 1.4.1 脂类在植物中的作用
• 1.4.2 脂类在植物抗病性中的作用
• 1.4.2.1 乙酰辅酶A合成酶（acctyl-CoA synthetases）
• 1.4.2.2 萤火虫荧光素酶（luciferases）
• 1.4.2.3 4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase）
• 1.4.2.4 聚酮化合物生物合成酶类（polyketide synthetase）
• 1.5 本研究的目的意义和主要研究内容
• 1.5.1 选题依据及研究的目的和意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 1.6 研究的技术路线
• 第二章 水稻锚蛋白基因OsBIHN-N22的克隆鉴定及其基因表达分析
• 摘要
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 水稻幼苗的培育与处理
• 2.2.2 OsBIHN-N22 cDNA基因的克隆
• 2.2.3 DNA测序和序列分析
• 2.2.4 pSGFP-OsBIHN-N22蛋白的核定位分析
• 2.2.4.1 pSGFP-OsBIHN-N22重组质粒的构建
• 2.2.4.2 金粉悬浮液的制备及金粉pSGFP-OsBIHN-N22样品的包埋
• 2.2.4.3 基因枪轰击
• 2.2.5 水稻基因组的Southern杂交分析
• 2.2.6 Northern杂交分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 OsBIHN-N22基因编码水稻的一个锚蛋白
• 2.3.2 OsBIHN-N22编码的是一种Ankyrin Repeat锚蛋白
• 2.3.3 OsBIHN-N22在水稻基因组中的结构分析
• 2.3.4 OsBIHN-N22蛋白位于细胞膜上
• 2.3.5 OsBIHN-N22基因在水稻抗病反应中的差异表达
• 2.4 讨论
• 第三章 水稻酯酰辅酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鉴定与表达分析
• 摘要
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试水稻、处理和接种
• 3.2.2 水稻OsBNHN-N7基因cDNA序列的克隆
• 3.2.3 DNA测序和序列分析
• 3.2.4 Southern印迹杂交
• 3.2.5 Nouthern印迹杂交分析
• 3.2.6 OsBNHN-N7融合蛋白的原核表达
• 3.2.6.1 原核表达载体pRSET A-OsBNHN-N7的构建
• 3.2.6.2 OsBNHN-N7蛋白的诱导表达及制备
• 3.2.6.3 OsBNHN-N7蛋白的纯化
• 3.2.7 OsBNHN-N7蛋白的亚细胞定位分析
• 3.2.7.1 326-GFP3G-OsBNHN-N7重组质粒的构建
• 3.2.7.2 样品包埋与基因枪轰击
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 OsBNHN-N7基因编码一个水稻酯酰辅酶A合成酶
• 3.3.2 OsBNHN-N7在水稻基因组中的结构分析
• 3.3.3 OsBNHN-N7蛋白的原核表达
• 3.3.4 OsBNHN-N7蛋白的亚细胞定位
• 3.3.5 OsBNHN-N7基因在水稻抗病反应中的差异表达
• 3.4 讨论
• 全文总结和今后研究
• 参考文献
• 致谢