论文摘要
可注射的对pH或者温度敏感的智能水凝胶材料,近些年来被研究者广泛的关注。首先它可以在体外以流动性很好的液态形式复合药物,生长因子以及细胞等,然后以微创的方式,通过注射器或者内窥镜植入体内的器官或者缺损部位,因温度或者其他因素的影响,快速在原位形成凝胶,发挥其功效。壳聚糖是一种天然的多聚物,酸性环境下可以以液体形式存在,是甲壳素部分脱乙酰后的产物,具有天然的抗菌性和可生物降解和生物相容性好的优点。之前有研究者利用酸性的壳聚糖溶液,与一种弱碱性物质,β-甘油磷酸钠（beta-glycerophosphate, GP）混合,制备了一种对温度敏感的壳聚糖/GP可注射凝胶,由于壳聚糖的结构和糖胺聚糖相似等优点,此类材料被广泛应用于软骨缺损,髓核再生修复等领域,取得了良好的效果。同时由于壳聚糖在骨组织工程研究中体现出的良好性能,诸如促进成骨细胞生长等,使得壳聚糖/GP水凝胶材料被引入到骨组织工程的研究中来。但是,考虑到单一的壳聚糖被证明促成骨作用有限,本研究引入了另一种被广泛应用的天然生物材料,Ⅰ型胶原,到壳聚糖/GP水凝胶中去。Ⅰ型胶原是一种天然的骨组织的细胞外基质（ECM）,同时,很多实验证明其对促成骨细胞吸附和支持生长其着良好的作用。所以,本实验致力于构建一种壳聚糖/胶原/GP为基底的复合的温敏水凝胶支架材料。并且对它的理化性能,比如pH值、凝胶时间、渗透压、超微结构等进行检测。同时着重检测此水凝胶支架材料对骨髓基质细胞以及牙周膜细胞的生物相容活性,观察细胞在材料中的生长以及分化特性。最后将此种材料复合犬骨髓基质细胞和人牙周膜细胞植入裸鼠皮下,观察其在体内的生物相容性,检测其成骨性能,研究此壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架应用于骨组织工程的潜力,本实验主要由以下几部分构成。第一部分壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架的构建及理化性能分析目的：构建一种方便操作、适合作为细胞载体、理化性能好的可注射壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架。方法：按一定比例先后混合壳聚糖、胶原、GP溶液,制备壳聚糖/胶原/GP水凝胶。通过倒置试管观察流动性记录其凝胶时间,pH计,渗透压计等记录其理化指标。结果：制备的壳聚糖/胶原/GP水凝胶pH值为7.09-7.21,凝胶时间约为8分钟。其在普通培养液中的渗透压为295-315mmol/kg。结论：具有生理pH和渗透压的壳聚糖/胶原/GP水凝胶适合应用于后续的体内,体外研究。8分钟左右的凝胶时间也便于操作者将其作为载体,在液态下复合细胞,药物等物质,进行后续的体内体外实验。第二部分壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架材料对BMSCs的细胞毒性检测,细胞在支架内超微结构观察,壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架应用于骨组织工程的评估目的：检测壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架对骨髓基质细胞的生物学毒性,以及材料本身的成骨性能,评估其用于骨组织工程的潜力方法：1.接种一定数量的BMSCs于壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架,37度孵箱内低糖培养基培养,分别于1天和7天使用live/dead细胞活性检测试剂盒检测细胞在支架内的活性。2.同法接种一定量细胞于支架中,一部分带细胞支架在普通低糖培养基孵育三天后对细胞进行扫描电镜观察,另一部分带细胞支架经成骨诱导28天时,进行扫描电镜观察。3.将预先成骨诱导一周的BMSCs接种于裸鼠皮下,4周后取材进行组织学以及免疫组织化学的检测。所有实验均采用壳聚糖/GP支架进行对照。结果：1.超过95%的受试细胞依然在两种支架中存活。2.扫描电镜下见,壳聚糖/GP支架中的细胞未充分伸展且较难与壳聚糖小球分辨,而细胞在壳聚糖/胶原/GP支架内伸展良好,清晰可辨。在28天成骨诱导的BMSCs-壳聚糖/胶原/GP支架内观察到了数量较多的骨矿化结节样结构。3.组织学结果显示,BMSC-壳聚糖/胶原/GP组中观察到了自发生成的血管以及类骨样结构,其余组未见。结论：壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架适合骨髓基质细胞生长,支持预矿化诱导的细胞在支架中继续成骨分化,有着很好的骨组织工程支架材料的应用潜力。第三部分壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架对HPLCs的生物相容性检测,细胞支架复合材料的超微结构观察,壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架应用于牙周骨组织缺损修复的可行性分析目的：检测壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架对HPLCs（?）的细胞生物相容性,超微结构下细胞在支架材料内的生长,评估壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架应用于牙周组织工程的潜力方法：1.同实验二部分,检测1,7天时细胞在材料中的活性。2.同实验二部分,扫描电镜观察超微结构下细胞在材料内的生长与成骨分化。3.在接种细胞到材料的同时,复合一定量的bmp-2于支架中,植入裸鼠皮下,两周后取材,组织学检测。结果：1.与BMSCs相似,同样有超过95%的细胞在支架材料中存活。2HPLCs在支架材料中伸展良好,经过4周的体外成骨诱导培养的支架中同样发现矿化结节样结构。3.两周的裸鼠皮下植入物组织学结果显示,实验组的材料内显现明显的软骨细胞以及成骨样细胞结构的陷窝。结论：壳聚糖/胶原/GP水凝胶支架对HPLCs的细胞生物相容性好,细胞在材料中生长和吸附良好,此材料有很强的潜力应用于牙周骨组织缺损的修复。
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