几种名贵洋兰转基因受体系统的建立及遗传转化

论文题目: 几种名贵洋兰转基因受体系统的建立及遗传转化

论文类型: 博士论文

论文专业: 林木遗传育种

作者: 李杰

导师: 王明庥,黄敏仁

关键词: 蝴蝶兰,大花蕙兰,文心兰,植株再生,农杆菌介导,转基因

文献来源: 南京林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 研究了蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰转基因受体系统的建立和抗病基因转化,结果表明: （1） 由蝴蝶兰种子播种可获得大量无菌材料,在Hyponex培养基上,蔗糖浓度为25g/L时,种子萌发情况最好;也可从花梗节芽诱导营养芽从而建立快繁无菌体系,营养芽增殖的最佳激素组合为6-BA7.5mg/L+NAA1.0mg/L;在6-BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L的激素组合下,从无菌苗的叶片诱导类原球体的诱导率最高可达87.0%,1/2MS和Hyponex基本培养基对类原球体的增殖和分化效果较好;蔗糖浓度对类原球茎分化成苗的影响可用二次曲线拟合,在浓度为20g/L时,分化率达最高。 （2） 基因型对大花蕙兰丛生芽增殖有显著影响,差异的显著性在不同基因型间达不同水平,离散性和集中性具有分组特性;影响大花蕙兰丛生芽增殖系数差异的主要因子是细胞分裂素的浓度水平,二者关系可用二次式模型拟合;激素对愈伤组织的诱导和体胚发生的影响达极显著差异,2,4-D浓度升高,愈伤组织诱导率增加,但高于2.0mg/L时,外植体褐化死亡,KT是体胚发生的关键因子,其作用受到2,4-D的抑制和低浓度NAA的促进;石蜡切片观察表明,大花蕙兰体胚发生经过球形胚、鱼雷胚,最后发育成子叶胚,形成具有完整植株特性的原球茎。 （3） 以文心兰花梗为材料,在6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L的1/2MS培养基上,花梗营养芽的诱导率可达60%;花梗营养芽的茎段,在6-BA0.2mg/L+NAA1.0mg/L的培养基上,愈伤组织诱导率最高可达78%,诱导率受[NAA]/[6-BA]浓度比和光照强度的影响;在6-BA0.4mg/L+NAA0.2mg/L的激素组合下,从愈伤组织分化出幼苗的形成率和商品化率可达到最佳效果,中、低无机盐浓度且全量的基本培养基较利于幼苗分化;当分化形成的幼苗株高为1～2cm时,可进一步状苗生根,生根苗在适宜条件下移栽,成活率可达99%以上。 （4） 以蝴蝶兰叶片为外植体进行农杆菌介导,最优化的转化条件为预培养时间4～5d,菌液浸染浓度OD600=0.05,菌液浸染时间10分钟,pH值=5.4。浸染后,宜采用农杆菌渐次脱菌法,即在无任何抗生素的培养基上与农杆菌共培养5天后,在添加20mg/L的Cef培养基上继续共培养3个星期后,用加入了500mg/L Cef的诱导培养基,对外植体进行洗涤,再转入添加Cef50mg/L+Km10mg/L筛选培养基中继代培养,20d继代一次,优化条件下,Kmr抗性原球茎的分化率最高达到了16.2%,比基本转化条件下的最高分化率3.5%提高近5倍;在已获得的280株抗性芽中,随机抽取16株植株进行PCR检测,初步证明外源GAFP-NP1基因已整合到Kmr抗性植株的基因组中。 （5） 将适宜蝴蝶兰叶片遗传转化的条件直接运用于大花蕙兰和文心兰,仅能得到较低的转化率,除去各种原因损失的抗性芽外,目前有8株大花蕙兰和4株文心兰抗性芽表现出正常生长;为实现转化体的早期准确筛选,成功构建了pBin35S-GFP表达载体,可运用于大花蕙兰和文心兰乃至其它兰花遗传转化的研究中。

论文目录:

致谢

摘要

Abstract

上篇 文献综述

第一章 兰花育种技术研究及应用

1.杂交育种

2.诱变育种

3.体细胞杂交

4.基因工程育种

5.人工种子生产

6.兰花杂交种登记和品种评审制度

第二章 兰花快繁技术的研究及应用进展

1.兰花种子的无菌播种技术

2.组织培养技术

3.兰花细胞工程技术

4.兰花产业化的现状与未来

第三章 兰花主要病害调查

1.常见真菌性病害

1.1 疫病

1.2 根腐病

1.3 炭疽病

1.4 叶枯病

1.5 煤烟病

2.常见细菌性病害

2.1 软腐病

2.2 兰花蘖腐病

2.3 兰花褐腐病

2.4 兰花褐斑病

3.常见病毒性病害

3.1 毒素病

3.2 兰花环斑病

3.3 兰花丛枝病

第四章 农杆菌介导单子叶植物基因转化

1. 农杆菌对单子叶植物转化

2.影响农杆菌转化单子叶植物的因素

3.实现农杆菌对单子叶植物转化的途径

下篇研究报告

第五章 蝴蝶兰离体叶片诱导植株再生体系的建立

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 实验设计

2.2.1.1 无菌体系的建立

2.2.1.1.1 种胚无菌播种获得无菌体系

2.2.1.1.2 花梗苗和花梗芽的诱导

2.2.1.1.3 丛生芽诱导体系的建立

2.2.1.2 叶盘植株的分化和再生

2.2.1.2.1 类原球体的诱导

2.2.1.2.2 类原球体的增殖和分化

2.2.1.2.3 植株再生

2.2.2 计算方法

3.结果与分析

3.1 无菌播种幼苗的获得

3.2 丛生芽诱导体系的建立

3.2.1 植物激素对花梗营养芽诱导的影响

3.2.2 花梗不同部位节芽的诱导效果

3.2.3 植物激素对丛生芽增殖的影响

3.3 植物激素对叶片诱导类原球体的影响

3.4 基本培养基对类原球体的增殖和分化影响

3.5 蔗糖浓度对植株再生的影响

4.讨论

第六章 大花蕙兰体细胞胚胎发生和植株再生

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 丛生芽诱导体系的建立

2.2.2 体细胞胚胎的诱导

2.2.3 实验设计

2.2.4 石蜡切片方法

2.2.5 计算方法

3.结果与分析

3.1 各品种芽增殖情况的总体特征

3.2 不同基因型繁殖系数的差异性分析

3.3 不同激素组合及浓度对愈伤组织诱导和体胚发生的影响

3.4 基因型对愈伤组织诱导率和胚胎发生率的影响

3.5 体胚发生的组织学观察

4.讨论

第七章 文心兰愈伤组织诱导及其分化系统的建立

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 花梗腋芽的诱导

2.2.2 愈伤组织的形成及分化

2.2.2.1 愈伤组织的诱导

2.2.2.2 愈伤组织的分化

2.2.3 植株再生

2.2.4 计算方法

3.结果与分析

3.1 植物激素对文心兰花梗启动分化的影响

3.2 文心兰花梗不同部位营养芽的诱导效果

3.3 植物激素和光照条件对文心兰幼苗茎段愈伤诱导的影响

3.4 植物激素和基本培养基对文心兰愈伤组织分化的影响

3.5 文心兰状苗生根和出瓶移栽

4.讨论

第八章 蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰对抗生素的敏感性反应

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 培养基

1.2.2 接种

1.2.3 数据统计方法

2.结果与分析

2.1 Cef对蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰形态分化的影响

2.2 Km对蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰形态分化的影响

2.3 Km对蝴蝶兰、大花蕙兰和文心兰生根的影响

3.讨论

第九章 农杆菌介导双价抗病基因转化蝴蝶兰

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物受体材料

2.1.2 酶和试剂

2.1.3 质粒和菌株

2.1.4 PCR扩增引物

2.1.5 培养基

2.1.5.1 细菌培养基

2.1.5.2 植物培养基

2.1.6 仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 碱法小量提取质粒DNA

2.2.2 农杆菌感受态细胞制备

2.2.3 液氮冻融法转化农杆菌

2.2.4 共培养转化

2.2.5 Km~r的分子检测

2.2.5.1 PCR检测

2.2.5.1.1 Km~r植株总DNA的提取

2.2.6.1.2 Km~r植株的PCR检测

3.结果与分析

3.1 转化条件对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.1 预培养时间对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.2 浸染菌液浓度对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.3 浸染时间对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.4 共培养时间对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.5 pH值对Km~r抗性原球茎诱导的影响

3.1.6 优化条件下大量Km~r抗性原球茎的获得

3.2 转NP-1和GAFP双价抗病基因的Km抗性植株PCR分析

4.讨论

第十章农杆菌介导pBin35SGAFP-NPl转化大花蕙兰和文心兰及pBin35S-GFP表达载体的构建

1.前言

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 pBin35SGAFP-NP1的转化

2.1.1.1 植物受体材料

2.1.1.2 酶和试剂

2.1.1.3 质粒和菌株

2.1.1.4 培养基

2.1.1.4.1 细菌培养基

2.1.1.4.2 植物培养基

2.1.1.5 仪器与设备

2.1.2 pBin35S-GFP表达载体的构建

2.1.2.1 菌株和质粒

2.1.2.2 试剂

2.2 方法

2.2.1 pBin35SGAFP-NPI的转化

2.2.1.1 共培养转化

2.2.2 pBin35S-GFP表达载体的构建

2.2.2.1 培养基配制

2.2.2.2 细菌培养

2.2.2.3 质粒提取

2.2.2.4 质粒的酶切分析

2.2.2.5 酶切片段凝胶电泳

2.2.2.6 连接反应

2.2.2.7 大肠杆菌(转化pB120质粒)感受态的制备

2.2.2.8 转化

2.2.2.9 重组阳性质粒提取

2.2.2.10 表达载体的酶切分析

2.2.2.11 酶切片段凝胶电泳

2.2.2.12 农杆菌感受态细胞制备

2.2.2.13 液氮冻融法转化农杆菌

3.结果与分析

3.1 转NP-1和GAFP双价抗病基因的Km抗性植株的获得

3.2 pBin35S-GFP表达载体的构建

4.讨论

第十一章 结论与讨论

1.植株再生系统的建立

1.1 蝴蝶兰离体叶片诱导植株再生体系的建立

1.2 大花蕙兰体细胞胚胎发生和植株再生

1.3 文心兰愈伤组织诱导及其分化系统的建立

2.基因转化条件的优化及转抗病基因植株的获得

3.研究的创新性意义及存在的问题

3.1 创新点及其意义

3.2 存在问题及进一步研究展望

参考文献(Reference)

附录: 作者简介

发布时间: 2005-12-30

参考文献

• [1].大花蕙兰产业化栽培技术若干问题研究[D]. 赵九洲.南京林业大学2004
• [2].大花蕙兰杂交育种研究[D]. 王利民.北京林业大学2007
• [3].大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究[D]. 吴开云.南京林业大学2008
• [4].盆栽花卉缺素症及硫高效植物千日红（Gomphrena globosa L.）的营养生理研究[D]. 王敏艳.浙江大学2011

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• [3].北美—球悬铃木转基因受体系统的建立及遗传转化研究[D]. 邹永梅.南京林业大学2005
• [4].云南濒危野生兰花与菌根真菌的相互关系[D]. 伍建榕.南京林业大学2005
• [5].月季品种‘萨蔓莎’植株再生体系的建立和根癌农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 高莉萍.华中农业大学2005
• [6].香樟体胚发生途径的植株再生体系的建立以及农杆菌介导遗传转化的初步研究[D]. 杜丽.华中农业大学2005
• [7].蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究[D]. 韩颖颖.复旦大学2005
• [8].大花蕙兰杂交育种研究[D]. 王利民.北京林业大学2007
• [9].蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）抗冷特性研究[D]. 刘学庆.山东农业大学2007
• [10].大花蕙兰抗病转基因体系及相关技术研究[D]. 吴开云.南京林业大学2008

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