PRRSV重组NSP7蛋白ELISA检测方法的建立

论文摘要

目前,猪繁殖与呼吸综合征依然是世界养猪业的一大难题。猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组长约15KB,为单正链RNA病毒,它含8个开放阅读框,编码nsp7蛋白的基因是ORF1,该基因位于基因组的5’端。目前的研究表明NSP7蛋白是一个可用于检测PRRSV血清抗体的理想蛋白,其具备以下几个特征：NSP7蛋白以可溶性蛋白的方式进行表达,利于蛋白的表达与纯化。在检测分析大量样本时,能够提供足够的抗原；NSP7蛋白在同一基因型中有很高的同源性；PRRSV感染后机体内产生的抗nsp7抗体的水平很高,可持续到202天以后。设计引物,利用RT-PCR的方法从PRRSV BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将扩增得到的产物连接至表达载体pET28a。将重组质粒pET28a-nsp7转化至BL21（DE3）细菌中,鉴定并测序。进行IPTG诱导表达后,表达结果用SDS-PAGE分析。结果表明成功表达了分子量大小约为33KDa的重组蛋白。表达蛋白用Ni-NTA树脂进行纯化,Western blot分析,表明重组蛋白具有良好的抗原性。以重组nsp7蛋白为检测抗原,建立了检测PRRSV抗体的ELISA试剂盒。对试剂盒进行了符合研究,比较NSP7-ELISA和IDEXX试剂盒的检测结果,二者的阳性符合率为87.59%,阴性符合率为76%,重复率为86.9%,表明NSP7-ELISA有很高的敏感性和特异性。本实验成功构建了pET28a-nsp7原核表达载体,并利用大肠杆菌表达系统使目的蛋白高效表达,得到大小约为33kDa的重组蛋白；建立了重组蛋白纯化方法,并以NSP7蛋白为抗原建立了检测猪血清PRRSV抗体的ELISA检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1. 猪繁殖与呼吸综合征病毒的发现历史及分类
• 2. 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展
• 2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组
• 2.2 病毒的变异
• 2.3 PRRSV免疫学研究进展
• 2.4 PRRSV ADE研究进展
• 3. PRRS流行病学特点
• 4 诊断方法的研究进展
• 4.1 病毒的分离
• 4.2 分子生物学检测
• 4.3 病毒抗原检测
• 4.4 血清学检测
• 5 研究的目的和意义
• 第二章 NSP7蛋白的表达与纯化
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 细胞
• 1.3 病毒
• 1.4 酶、菌种、质粒
• 1.5 主要试剂的配制
• 2. 方法
• 2.1 PRRSV BJ-4毒株总RNA的提取和cDNA的合成
• 2.2 nsp7基因片段的扩增
• 2.3 克隆载体PMD-19-T与nsp7的连接
• 2.4 连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞
• 2.5 重组质粒PMD-19-T-nsp7的筛选和鉴定
• 2.6 原核表达载体pET28a-nsp7的构建
• 2.7 重组质粒pET28a-nsp7在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.8 原核表达蛋白NSP7的纯化
• 2.9 纯化蛋白SDS-PAGE鉴定
• 2.10 纯化蛋白Western-blot分析
• 3 结果
• 3.1 PRRSV BJ-4毒株总RNA的提取和cDNA的合成
• 3.2 原核表达载体pET28a-nsp7的构建
• 3.3 重组蛋白的诱导表达
• 3.4 重组蛋白的纯化及Western-blot分析
• 4 讨论
• 第三章 PRRSV重组NSP7蛋白ELISA检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 纯化重组NSP7蛋白
• 1.2 主要试剂
• 1.3 阳性血清和阴性血清
• 1.4 待测血清
• 1.5 主要试剂的配置
• 2 方法
• 2.1 抗原包被浓度、血清稀释倍数的选择
• 2.2 抗原包被条件的选择
• 2.3 封闭条件的选择
• 2.4 血清最佳反应时间的选择
• 2.5 酶标二抗工作时间的选择
• 2.6 酶标二抗工作浓度的选择
• 2.7 间接ELISA检测临界值的确定
• 2.8 间接ELISA检测方法的建立
• 2.9 特异性实验
• 2.10 重复性试验
• 3 结果
• 3.1 抗原的最佳包被浓度、血清最佳稀释倍数
• 3.2 抗原包被条件的选择
• 3.3 封闭条件的选择
• 3.4 血清最佳反应时间的选择
• 3.5 酶标二抗工作时间的选择
• 3.6 酶标二抗工作浓度的选择
• 3.7 间接ELISA检测临界值的确定
• 3.8 间接ELISA检测方法的建立
• 3.9 特异性实验
• 3.10 重复性试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录：英文缩略词表
• 作者简历
• 硕士在读期间撰写和已发表的论文
• 致谢