论文摘要
为了研究I型聚酮合成酶特别是硫酯酶在链霉菌中acyltetramic acid类抗生素合成中的作用,以利迪链霉菌为例,改进PCR方法,运用基因阻断技术和LC/MS分析方法,试图从分子水平研究I型聚酮合成酶中的酮酰基合成酶、硫酯酶以及抗生素合成基因簇中的修饰酶S-腺苷蛋氨酸合成酶和细胞色素P450在利迪链菌素生物合成中的作用。运用FTIR技术测定发酵培养后的菌体,红外数据用PCA、HCA和ANN分析,试图找到利迪链霉菌开始合成利迪链菌素时的biomarker,以及用于突变株高通量筛选的方法。获得如下主要结果:针对链霉菌基因组DNA高GC含量的特点,改进了PCR体系。用改进的PCR体系克隆得到了硫酯酶II、3-氧酰基-ACP合成酶II、S-腺苷蛋氨酸合成酶以及细胞色素P450的基因片段,并确定3-氧酰基-ACP合成酶II、硫酯酶II和S-腺苷蛋氨酸合成酶参与了利迪链菌素的生物合成,而扩增得到细胞色素P450对利迪链菌素的合成没有直接影响。同时发现,链霉菌中acyltetramic acid类抗生素利迪链菌素的生物合成需要硫酯酶,不同于目前在真菌中发现的2种同类抗生素equisetin和fusarin C的生物合成。发酵培养基中添加L-蛋氨酸,L-赖氨酸,L-精氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸,引起菌体细胞内S-腺苷蛋氨酸含量的下降,导致利迪链菌素含量的下降,其中以蛋氨酸和精氨酸的效果最为显著。S-腺苷蛋氨酸可以提高利迪链菌素的产量,表明L-蛋氨酸不是利迪链菌素生物合成的直接前体,而主要是通过合成S-腺苷蛋氨酸,提供利迪链菌素结构中的N-甲基。H2O2通过诱导蛋白的表达,改变了菌体的正常代谢途径,降低了利迪链菌素的产量并积累了其他物质。运用FTIR技术结合PCA、HCA,很好地区分了处于不同发酵时间的利迪链霉菌AS 4.2501,并找到了利迪链霉菌合成利迪链菌素时可能的生物标志物（biomarkers）;尝试用FTIR技术结合ANN较好地预测了具有不同利迪链菌素合成能力的利迪链霉菌的突变株。表明基于代谢物组分析的FTIR技术与ANN的结合,有望用于菌株诱变后的高通量筛选。
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中文摘要ABSTRACT前言第一章 文献综述1.1 链霉菌基因及功能研究1.1.1 聚酮合成酶1.1.2 抗生素生物合成基因克隆的常用方法及优缺点1.1.3 链霉菌中基因阻断常用的方法1.1.4 阻断后基因功能分析的主要方法1.2 本论文的立题背景、意义及主要研究内容第二章 利迪链霉菌原生质体制备及PCR 体系的优化2.1 引言2.2 材料与方法2.2.1 菌种2.2.2 培养基及溶液2.2.3 利迪链霉菌基因组DNA 的提取2.2.4 PCR 反应体系及反应条件2.2.5 电泳2.2.6 菌体生长曲线的测定2.2.7 利迪链霉菌原生质体的制备及制备率和再生率的计算2.2.8 引物设计2.2.9 主要仪器设备2.2.10 药品及生化试剂2.3 结果与讨论2.3.1 原生质体制备条件的优化2.3.2 利迪链霉菌PCR 条件的优化2.4 小结第三章 利迪链霉菌3-氧酰基-ACP 合成酶Ⅱ基因的克隆及功能分析3.1 引言3.2 材料与方法3.2.1 菌种和质粒3.2.2 生化试剂和仪器3.2.3 试验方法3.3 结果与分析3.3.1 KS 基因的扩增及序列分析3.3.2 3-氧酰基-ACP 合成酶II 的功能分析3.4 小结第四章 硫酯酶Ⅱ基因的克隆及功能分析4.1 引言4.2 材料与方法4.2.1 引物设计4.2.2 其他方法4.3 结果与讨论4.3.1 利迪链霉菌中硫酯酶基因的克隆与序列分析4.3.2 硫酯酶II 在利迪链菌素生物合成过程中的作用4.4 小结第五章 S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的克隆及功能分析5.1 引言5.2 材料与方法5.2.1 引物设计5.2.2 利迪链霉菌菌体中S-腺苷蛋氨酸的提取及含量测定5.2.3 其他方法5.3 结果与讨论5.3.1 S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的克隆与序列分析5.3.2 出发菌株与突变株代谢产物的分析5.3.3 几种氨基酸对利迪链霉菌合成利迪链菌素能力的影响5.4 小结第六章 细胞色素P450 基因克隆及功能分析6.1 引言6.2 材料与方法6.2.1 引物设计6.2.2 其他方法6.3 结果与讨论6.3.1 利迪链霉菌中细胞色素P450 基因的克隆与序列分析6.3.2 出发菌株与突变株代谢产物分析6.4 小结2O2对利迪链霉菌代谢的调控及机理初探'>第七章 H2O2对利迪链霉菌代谢的调控及机理初探7.1 引言7.2 材料与方法7.2.1 菌种7.2.2 试验设计7.2.3 分析方法7.3 结果与讨论2O2对菌体生长及生理的影响'>7.3.1 不同浓度的H2O2对菌体生长及生理的影响2O2对菌体生长及生理的影响'>7.3.2 不同处理时间的H2O2对菌体生长及生理的影响2O2对菌体生长及生理的影响'>7.3.3 稳定期添加H2O2对菌体生长及生理的影响2O2处理对过氧化物酶、过氧化氢酶活性的影响'>7.3.4 H2O2处理对过氧化物酶、过氧化氢酶活性的影响7.3.5 发酵液乙酸乙酯萃取物的液相－质谱分析7.4 小结第八章 基于代谢物组分析区分利迪链霉菌及其突变株8.1 引言8.2 材料与方法8.2.1 菌株及其来源8.2.2 生化试剂和仪器8.2.3 试验方法8.2.4 数据处理8.3 结果与讨论8.3.1 运用FTIR 技术及PCA 分析区分利迪链霉菌及其突变株8.3.2 运用FTIR 技术及PCA 分析区分不同培养时间的菌体8.3.3 利迪链霉菌合成利迪链菌素生物标志物的筛选8.3.4 应用人工神经网络进行利迪链霉菌诱变菌株的筛选8.4 小结第九章 结论与展望9.1 结论9.2 展望参考文献发表论文和科研情况说明致谢
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