赤霞珠葡萄叶片中以白藜芦醇为底物的代谢酶的研究

论文摘要

白藜芦醇（Resrevatrol,Res）做为一种天然的多酚物质,在植物抗病、人类保健与抗病等方面有极其重要的作用。随着白藜芦醇生物活性的深入认识和实验技术的不断更新,人们在葡萄等多种植物中发现了白藜芦醇衍生物及其类似物,这些衍生物和类似物被认为是白藜芦醇的代谢产物。在植物逆境生理、植物病理和植物育种等研究领域被广泛关注。但是由于白藜芦醇代谢在苯丙氨酸代谢途径中至今还是一个空白,因而与其衍生物和类似物的关系至今仍不够清晰。本文在此背景下,以赤霞珠葡萄扦插苗叶片为试材,建立了白藜芦醇及其衍生物的高效液相色谱检测方法和提取方法,研究了紫外诱导后葡萄叶片中白藜芦醇及其部分重要衍生物的积累规律;确定了两种代谢白藜芦醇的酶分别是多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）;对白藜芦醇代谢酶的代谢机制进行了初步探讨和研究。主要研究结果如下:（1）紫外诱导、避光处理后,白藜芦醇、白藜芦醇糖苷、ε-viniferin,δ-viniferin、紫檀芪五种芪化物均大量积累,白藜芦醇在72h内出现两次合成高峰。除白藜芦醇糖苷以外,ε-viniferin,δ-viniferin、紫檀芪三种芪化物的合成高峰滞后于白藜芦醇,出现在白藜芦醇的第二个合成高峰;（2）实验发现PPO代谢白藜芦醇的主要产物为ε-viniferin,而POD代谢白藜芦醇的产物为δ-viniferin。在两种酶的粗酶反应体系中还存在白藜芦醇代谢的中间产物或其他产物。因此,本实验证明,白藜芦醇至少存在两种以上的代谢途径;（3）通过离子交换柱（Q-Sepharose FF）层析和疏水亲和柱（Butyl-Sepharose FF）层析得到的酶蛋白,电泳结果表明:纯化后酶液中一种代谢白藜芦醇的PPO,分子量约为41.5kD,该酶不存在多亚基现象,其代谢产物为ε-viniferin;（4）虽然紫外诱导后葡萄叶片中δ-viniferin大量积累,但是电泳结果显示,没有新的POD同功酶合成。通过H2O2抑制实验,验证了POD在白藜芦醇代谢中的作用;同时表明紫外处理、H2O2和POD三者是白藜芦醇代谢合成δ-viniferin的充分必要条件。以上实验结果初步确定了白藜芦醇两条代谢途径,填补了苯丙氨酸代谢途径中白藜芦醇代谢的空白,为进一步探讨白藜芦醇及其衍生物在逆境生理中的作用及调控机制的研究奠定了必要的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 白藜芦醇概述
• 1.1 白藜芦醇简述
• 1.2 Res诱导及生物合成
• 1.2.1 影响Res合成的内在因素
• 1.2.2 影响Res合成的外部因素
• 1.3 Res的生物活性
• 1.3.1 抗癌作用
• 1.3.2 抗菌、抗病毒作用
• 1.3.3 抗心血管疾病
• 1.3.4 消炎
• 1.3.5 免疫作用
• 1.3.6 雌激素样作用
• 2 Res衍生物的研究进展
• 2.1 Res衍生物的基本结构
• 2.1.1 Res聚合体
• 2.1.2 羟基类似物
• 2.1.3 甲基化衍生物
• 2.1.4 酯类衍生物
• 2.1.5 其他
• 2.2 Res衍生物生物活性
• 2.2.1 Res聚合体的生物活性
• 2.2.2 Res羟基衍生物的生物活性
• 2.2.3 Res甲基化衍生物的生物活性
• 2.2.4 Res酯类衍生物的生物活性
• 2.2.5 其他
• 2.3 Res及其衍生物的检测分析
• 2.3.1 定性检测
• 2.3.2 定量检测
• 3 Res及其衍生物的合成代谢研究进展
• 3.1 Res及其衍生物的合成途径
• 3.2 Res代谢酶的推测
• 4 研究目的及意义
• 第二章 白藜芦醇及其衍生物检测方法与提取方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂及仪器
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验仪器
• 1.1.3 实验标样及试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 葡萄叶片的紫外处理
• 1.2.2 Res及其衍生物的提取
• 1.2.3 色谱条件
• 1.2.4 Res二聚体（δ-viniferin）的制备
• 1.2.5 Res及其衍生物标准溶液的制备
• 2 结果与分析
• 2.1 Res及其衍生物分析方法的建立
• 2.1.1 色谱条件的优化
• 2.1.2 提取条件的优化
• 2.1.3 线性分析、检出限与回收率
• 2.2 Res聚合体（δ-viniferin）标准样品的制备
• 2.3 样品的检测与分析
• 3 紫外诱导后不同避光时间对Res及其衍生物的影响
• 4 本章小结
• 第三章 代谢白藜芦醇的多酚氧化酶的纯化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、仪器及试剂
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验仪器
• 1.1.3 实验试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 提取粗酶
• 1.2.2 透析
• 1.2.3 离子交换柱（Q-Sepharose FF）层析
• 1.2.4 疏水亲和柱（Butyl-Sepharose FF）层析
• 1.2.5 酶反应
• 1.2.6 蛋白浓度检测
• 1.2.7 Res及其衍生物的检测（HPLC）
• 1.2.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 2 结果与分析
• 2.1 酶反应体系中Res及其衍生物的检测分析
• 2.2 离子交换柱（Q-Sepharose FF）层析
• 2.3 疏水亲和柱（Butyl-Sepharose FF）层析
• 2.4 酶的纯度鉴定
• 2.5 多酚氧化酶的纯度鉴定
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第四章 过氧化物酶代谢白藜芦醇的机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂及仪器
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验仪器
• 1.1.3 实验试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 材料的处理
• 1.2.2 葡萄叶片中过氧化物酶粗酶的提取、总酶活及其蛋白的测定
• 1.2.3 葡萄叶片中可溶性过氧化物酶和结合态过氧化物酶的提取及蛋白的测定
• 1.2.4 酶反应及其反应体系中白藜芦醇及其衍生物HPLC检测
• 1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 1.2.6 抑制剂材料的处理
• 1.2.7 过氧化氢含量的测定
• 1.2.8 白藜芦醇及其衍生物的提取与检测
• 2 结果与分析
• 2.1 紫外处理后不同避光时间对过氧化物酶总酶活的影响
• 2.2 可溶性过氧化物酶和结合态过氧化物酶反应体系中白藜芦醇及其衍生物的分析
• 2.3 可溶性过氧化物酶和结合态过氧化物酶同功酶电泳分析
• 2O₂的影响'>2.4 紫外处理对H₂O₂的影响
• 2O₂含量和过氧化物酶活性的影响'>2.5 不同抑制剂处理对H₂O₂含量和过氧化物酶活性的影响
• 2.6 不同抑制处理对Res及其二聚体（ε-viniferin、δ-viniferin）含量的影响
• 2O₂清除剂对白藜芦醇及其二聚体（ε-viniferin、δ-viniferin）含量的影响'>2.7 H₂O₂清除剂对白藜芦醇及其二聚体（ε-viniferin、δ-viniferin）含量的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 结语
• 1 结论与创新
• 2 研究中尚未解决的问题
• 3 展望
• 参考文献
• 缩写词说明
• 附录1:实验仪器
• 附录2:实验试剂与标准样品
• 个人简历
• 在读期间发表论文及论著情况
• 致谢