胃癌基因组DNA拷贝数改变和miRNA表达谱研究

论文摘要

胃癌在全世界范围内是处于发病率第二位的恶性肿瘤,处于癌症死因谱的第二位。在中国,胃癌的发病率高居各种恶性肿瘤之首,每年新确诊患者达40万,大约死亡26万/年,占所有恶性肿瘤死亡的23.24%,同时仍然呈上升趋势。由于胃癌患者经常处于晚期才被确诊,因而其预后较差,五年生存率低于20%。导致胃癌发生的因素很多,包括胃幽门螺旋杆菌H. pylori感染,饮食,环境和遗传因素等。尽管对于胃癌的分子遗传学研究已经开展多年,发现了一系列诸如TP53, CDH1、APC, TGFBR2、FGF2、MET等胃癌相关的癌基因与抑癌基因,但是导致胃癌发生的分子遗传学改变和机制仍然有待阐明。同时,由于胃癌的高度异质性,遗传学改变的差异导致了患者个体在发病机理和临床转归方面的差异性较大。比较基因组杂交（CGH or array-CGH）结果显示胃癌患者基因组DNA拷贝数改变（copy number aberrations, CNAs）的不同模式与其临床表现和预后存在明显的相关性。因此,对胃癌进行基因组水平的DNA拷贝数改变分析,不仅能够对胃癌发生分子机制进行进一步的阐释并提供具有临床指导意义的肿瘤标记物,而且能够为开发新一代的诊断参数提供依据,以在临床实践中更好地指导胃癌的分子分型和个体化治疗。多重连接依赖探针扩增（Multiple ligation-dependent probe amplification, MLPA）技术是一种用于分析DNA拷贝数变化的新技术,可以通过很少量的基因组DNA （20-100ng）在单一反应中同时检测45个核酸序列的拷贝数变化。在本研究中,我们在全基因组范围内选取了112个肿瘤相关基因位点作为MLPA的探针,在50例不同分期、分级和转移程度的经显微切割的肠型胃癌组织中利用MLPA技术进行了全面的DNA拷贝数分析。我们发现的拷贝数增加位点包括3p22、6p21、8q24和20q13,拷贝数减少位点包括lp36、9p21和17p13.1,这些结果与已发表的胃癌比较基因组杂交的研究结果具有高度的一致性,表明MLPA技术是一种可靠而有效的分析胃癌组织基因组DNA拷贝数改变的方法。我们还发现,淋巴结转移阴性样本中的CNA位点数目明显低于淋巴结转移阳性样本,统计学分析结果证实在肠型胃癌中CNA的位点数目与淋巴结转移状态呈正相关（P<0.05）。另外,依据聚类分析和CNA数目分析的结果,我们将50例肠型胃癌样本成功分成两个亚型：带有较多CNA的G1+2亚型,和带有较少CNA的G3+4亚型。其中,3p22.1、4q25、11p13和12p13.32位点的拷贝数增加,以及1p36、6p21.3、9p21.3、12p13.3和17p13.1位点的拷贝数减少在G1+2亚型中很明显,而高频率的20q13.13位点的拷贝数增加则是G3+4亚型的标志性事件。在两种亚型之间,淋巴结转移状态具有显著性差别（P=0.034）。此外,我们还发现胃癌中染色体4q25和11p13 （EHF）位点的高水平扩增,并且本文第二部分的表达分析实验结果显示位于染色体4q25的miR-302c在胃癌组织中存在过表达。最后,统计学分析还证实MDM2基因的拷贝数与胃癌TNM分期呈正相关（P<0.05）, 11p13 （EHF）的扩增、9p21.3（CDKN2A）、11q13.3.17q25.3 （TIMP2）和22q11.23（MIF）的缺失与胃癌的淋巴结转移具有相关性（P<0.05）。我们建立的这种以DNA拷贝数改变的幅度和频率为基础的胃癌分子分型标准,具有在临床病理检测中应用的潜力,可以作为辅助手术决策的指标之一。微小RNA（miRNAs）是一种小分子非编码RNA,通过抑制靶基因mRNA的翻译或诱导mRNA的降解调节大约30%人类基因的表达。近年来,大量的研究表明miRNA在细胞增殖、凋亡、发育、分化和代谢等过程中发挥了重要的作用。最近,miRNA的表达被证明与肿瘤的发生发展有密切关系。如果一个miRNA在某种肿瘤中表达下调并且其靶基因是癌基因,那么这个miRNA就发挥抑癌基因的作用；同理,如果一个miRNA在某种肿瘤中表达上调并且其靶基因是抑癌基因或重要的控制分化基因,那么它就发挥癌基因的作用。因此,通过对胃癌组织中miRNA表达谱的分析找到在胃癌中表达失调的miRNA,并进一步确定其靶基因及其参与的信号调节通路,将对阐明胃癌发生的分子机制具有重要的理论意义。而且,miRNA作为重要的生长调节和细胞周期调控因子,具有成为新一代肿瘤标记物的潜力,对于胃癌的早期诊断、分期和预后提示均有重要的临床意义。在本文第二部分中,我们首先建立了将总RNA加ploy（A）尾后进行反转录PCR扩增特异miRNA,使用QuantityOne软件对PCR产物电泳结果进行定量分析,计算每对胃癌样本肿瘤与瘤旁组织比值（T/N Ratio）的实验平台系统——Poly（A）-tailed semi-quantitative RT-PCR技术,并通过miR-16的成功扩增和测序确认,证明该系统能够快速有效的分析miRNA的表达。进一步通过Pearson相关分析在2对样本中发现miR-21表达量的实时定量PCR结果与Poly（A）-tailed semi-quantitative RT-PCR的结果高度一致（相关系数r约等于1）,证明该实验和数据分析系统具有较好的可靠性和准确性。在上述工作基础上,我们使用该系统在8例胃癌及癌旁组织样本中对237个miRNA进行了表达谱分析,161个miRNA在电泳中可见到明显的产物条带,而76个miRNA未检测到扩增条带。对于检测到表达的161个miRNA,使用SAM软件进行统计分析,确认22个在胃癌中表达上调,2个在胃癌中表达下调（FDR=0.0963）。其中5个miRNA （miR-21、miR-223、miR-17-5p、miR-106a和miR-93）在胃癌组织中的过表达与同期发表的其他研究结果一致,而其余19个miRNA的表达差异均为首次报道。这些在胃癌中异常表达的miRNAs具有成为新一代胃癌标记物的潜力,能够为胃癌的精确诊断分型提供依据,同时针对这些靶点可以开发新的核酸治疗技术,通过抑制或增强其功能来达到治疗胃癌的目的。我们进一步通过生长抑制试验证实在胃癌组织中表达异常增高的miR-21和miR-17-5p对胃癌细胞的生长有明显的促进作用。通过生物信息学预测发现位于人类染色体lp36区域的CHD5基因的3’-UTR区324-330位的7个核苷酸序列在物种间具有高度的保守性,且与miR-17-5p的5’端的2-8位核苷酸完美互补。通过荧光素酶报告基因实验,我们确认了该位点即为miR-17-5p与CHD5mRNA相互作用的结合位点,miR-17-5p通过调节CHD5基因的转录后调控（抑制其蛋白翻译）行使调控作用。鉴于CHD5仅在脑和神经组织中表达及miR-17-5p在神经母细胞瘤中表达异常增高,我们推测miR-17-5p-CHD5-p19Arf-p53调节通路失调可能是神经母细胞瘤发生机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 应用多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术研究胃癌基因组DNA拷贝数的改变
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 1. 胃癌及胃粘膜正常组织样本基因组DNA的提取
• 2. MLPA测定样本基因组DNA的拷贝数相对值
• 3. 统计分析
• 实验结果
• 一、MLPA所获得的DNA拷贝数相对值的聚类分析结果
• 二、DNA拷贝数改变的数目
• 三、胃癌样本的分子分型
• 30% of tumors）'>四、频发的DNA拷贝数改变（Recurrent CNAs,>30% of tumors）
• 五、DNA拷贝数改变与临床病理参数的相关性
• 讨论
• 第二部分 胃癌的miRNA表达谱研究
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 1. 胃癌及胃癌旁组织样本总RNA的提取
• 2. 使用Poly（A）-tailed semi-quantitative RT-PCR方法分析胃癌中miRNA的表达情况
• 3. 使用Poly（A）-tailed real-time RT-PCR方法验证胃癌中miRNA及U6 snRNA的表达
• 4. 胃癌miRNA表达谱的定量分析
• 5. 研究Anti-miR-21和Anti-miR-17-5p对胃癌细胞系的生长抑制作用
• 6. 荧光素酶报告基因系统分析miR-17-5p与靶基因的相互作用
• 7. 使用逆转录病毒载体系统研究RUNX3基因在细胞周期调节方面的功能
• 8. 统计分析
• 实验结果
• 一、胃癌及胃癌旁组织样本总RNA的提取
• 二、建立Poly（A）-tailed semi-quantitative RT-PCR方法分析胃癌中miRNA表达
• 三、胃癌miRNA表达谱的定量分析
• 四、miR-21和miR-17-5p在胃癌细胞系中的生长调节作用
• 五、寻找miR-17-5p的靶基因并确认其调节机制
• 六、胃癌相关基因RUNX3在细胞周期调节方面的功能研究
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 英文名词及缩写
• 致谢
• 个人简历